微生物与基因工程

1、第十章 微生物与基因工程基因工程（genetic engineering）或重组DNA技术(recombinant DNA technology) 是指对遗传信息的分子操作和施工，即把分离到的或合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿主细胞内，使其扩增和表达，从而获得大量基因产物，或者令生物表现出新的性状。基因工程这个术语可以用来表示特定基因操作，也可泛指它所涉及的技术系统，其核心是构建重组体DNA的技术。因此，基因工程和重组DNA技术有时也就成为同义词。基因工程是在现代生物学、化学和化学工程学以及其他数理科学的基础上产生和发展起来的，并有赖于微生物学的理论和技术的发展和运用，微生物在基因工程的

2、兴起和发展过程中起着不可替代的作用。基因工程的出现是本世纪生物科学具有划时代意义的巨大事件，它使得生物科学获得迅猛发展，并带动了生物技术产业的兴起。它的出现标志着人类已经能够按照自己意愿进行各种基因操作，大规模生产基因产物，并且去设计和创建新的基因、新的蛋白质和新的生物物种，这也是当今新技术革命的重要组成部分。第一节 基因工程概述 一、基因工程的发展历史基因工程是在本世纪70年代初开始出现的。三项关键技术的建立为基因工程奠定了基础，这三项技术是：DNA的特异切割、DNA的分子克隆和DNA的快速测序。早在50年代，阿尔伯（Arber）的实验室就已发现大肠杆菌能够限制侵染的噬菌体，60年代末进而证

3、明大肠杆菌细胞内存在修饰限制系统，即给宿主自身DNA打上甲基化标记并切割入侵的噬菌体DNA。1970年史密斯（Smith）等人从流感嗜血杆菌（Hemophilus influenzae）中分离出特异切割DNA的限制酶。次年，内森斯（Nathans）等人用该酶切割猴病毒SV40 DNA，最先绘制出DNA的限制图谱（restriction map）。1973年史密斯和内森斯提出修饰限制酶的命名法。限制性核酸内切酶可用以在特定位点切割DNA，限制酶的发现使分离基因成为可能。为表彰上述科学家在发现和使用限制酶中的功绩，1978年的诺贝尔医学奖被授予阿尔伯、内森斯和史密斯。1973年，科恩（Cohen）

4、和博耶（Boyer）等将pSC101质粒作为载体与R质粒的四环素和卡那霉素的抗性基因相融合，并将重组体DNA转化大肠杆菌，首次实现了DNA的分子克隆。1975年桑格（Sanger）实验室建立了酶法快速测定DNA序列的技术。1977年吉尔伯特（Gilbert）实验室又建立了化学测定DNA序列的技术。分子克隆和测序方法的建立，使重组DNA技术系统得以产生。1980年诺贝尔化学奖被授予伯格、吉尔伯特和桑格，以肯定他们在发展DNA重组与测序技术中的贡献。1977年板仓（Itakura）和博耶用人工合成的生长激素释放抑制素（Somatostatin, SMT）基因构建表达载体，并在大肠杆菌细胞内表达成功

5、，得到第一个基因工程的产品。1982年，在建立转基因植物和转基因动物的技术上均获得重大突破。借助土壤农杆菌Ti质粒可将外源基因导入双子叶植物细胞内并发生整合，从而使植株获得新的遗传性状。同年通过基因工程方法把大鼠生长激素基因注射到小鼠受精卵的雄核中，然后移植到母鼠子宫内，由此培育出巨型小鼠。仅仅10年时间，基因工程在实践中迅速成熟，日趋完善。二、基因工程的基本过程生物的遗传性状是由基因（即一段DNA分子序列）所编码的遗传信息决定的。基因工程操作首先要获得基因，才能在体外用酶进行“剪切”和“拼接”，然后插入由病毒、质粒或染色体DNA片段构建成的载体，并将重组体DNA转入微生物或动、植物细胞，使其

6、复制（无性繁殖），由此获得基因克隆（clone，无性繁殖系的意思）。基因还可通过DNA聚合酶链式反应（PCR）在体外进行扩增，借助合成的寡核苷酸在体外对基因进行定位诱变和改造。克隆的基因需要进行鉴定或测序。控制适当的条件，使转入的基因在细胞内得到表达，即能产生出人们所需要的产品，或使生物体获得新的性状。这种获得新功能的微生物称为“工程菌”，新类型的动、植物分别称为“工程动物”和“工程植物”，或“转基因动物”和“转基因植物”。基因工程操作过程大致可归纳为以下主要步骤：分离或合成基因；通过体外重组将基因插入载体； 将重组DNA导入细胞；扩增克隆的基因；筛选重组体克隆；对克隆的基因进行鉴定或测序；控

7、制外源基因的表达；得到基因产物或转基因动物、转基因植物。上述步骤可用图10-1来表示。图10-1 基因工程基本操作过程示意图三、微生物学与基因工程的关系微生物和微生物学在基因工程的产生和发展中占据了十分重要的地位，可以说一切基因工程操作都离不开微生物。从以下六个方面可以说明：基因工程所用克隆载体主要是用病毒、噬菌体和质粒改造而成；基因工程所用千余种工具酶绝大多数是从微生物中分离纯化得到的；微生物细胞是基因克隆的宿主，即使植物基因工程和动物基因工程也要先构建穿梭载体，使外源基因或重组体DNA在大肠杆菌中得到克隆并进行拼接和改造，才能再转移到植物和动物细胞中；为大规模表达各种基因产物，从事商品化生

8、产，通常都是将外源基因表达载体导入大肠杆菌或是酵母菌中以构建成工程菌，利用工厂发酵来实现的；微生物的多样性，尤其是抗高温、高盐、高碱、低温等基因，为基因工程提供了极其丰富而独特的基因资源；有关基因结构、性质和表达调控的理论主要也是来自对微生物的研究中取得的，或者是将动、植物基因转移到微生物中后进行研究而取得的，因此微生物学不仅为基因工程提供了操作技术，同时也提供了理论指导。第二节 微生物与克隆载体外源DNA片段进行克隆，需要一个合适的载体，将其运送到细胞中并进行复制与扩增。这种以扩增外源DNA为目的载体，称为克隆载体（cloning vector）。作为克隆载体的基本要求是：（1）载体在细胞中

9、必须能够进行独立自主地复制。因此载体应是一个独立的复制子（replicon），具有复制起始序列，可在细胞中进行有效扩增。（2）载体必须具有若干限制酶的单一切割位点，便于外源DNA的插入。并且由于这些酶切位点位于载体复制的非必需区，故插入适当大小外源DNA片段后载体仍然能够进行正常的复制。（3）载体必须具有可供选择的遗传标记，例如具有抗生素的抗性基因，便于对阳性克隆的鉴别和筛选。（4）载体DNA须易于生长和操作。到目前为止，基因工程中使用的载体基本上均来自微生物，主要包括六大类：质粒载体；噬菌体载体；柯斯质粒载体；M13噬菌体载体；真核细胞的克隆载体；人工染色体等。一、质粒克隆载体1.质粒克隆载

10、体的特性 当前分子克隆中所用的克隆载体，绝大多数是利用细菌的质粒，经人工修饰改造而成。质粒作为克隆载体，具有十分有利的特性：（1）具有独立复制起点作为克隆载体的质粒，通常都含有一个复制起点，这是质粒在宿主细胞中进行扩增的必要条件。（2）具有较小的分子量 质粒是染色体外DNA，通常由环形双链DNA构成，其分子大小约为1200Kb。低分子量有利于DNA的分离和操作，但也限制其克隆外源DNA片段的大小，一般不超过15Kb。（3）具有较高拷贝数每个细胞可含有10200个拷贝的松弛型复制质粒。当加入蛋白质合成抑制剂（如氯霉素等），还可大大增加细胞中质粒的拷贝数，每个细胞可含有高达数千个拷贝的质粒，使外源

11、DNA得以大量扩增。（4）具有便于选择的标记 某些质粒中存在着抗生素的抗生基因，便于对克隆基因的检测和筛选。（5）易于导入细胞 质粒可通过转化或电穿孔等方法极易被导入细胞。（6）具有安全性 作为载体的质粒不具有转移功能，防止带有外源DNA的重组质粒扩散至实验室外，以免造成危害。2质粒pBR322的结构特点大肠杆菌质粒pBR322是基因工程中最常用和最具代表性的质粒（图102），它是由博利瓦（Bolivar）等人于1977年构建而成的，是一个典型的人工质粒载体。质粒pBR322是环状双链DNA分子，由4361bp组成。可插入外源DNA大小为5kb左右，外源DNA若超过10kb，质粒在复制时就会变

12、得不稳定。它具有一个复制起点，是松弛型质粒，故细胞中具有较高的拷具数，每个细胞含有2030个拷贝。当加入氯霉素扩增之后，每个细胞可含有10003000个拷贝，大大有利于重组质粒在细胞中的扩增。此外，pBR322还具有两种抗生素的抗性基因，一个是四环素抗性基因（Tetr）另一个是氨苄青霉素抗性基因（Ampr）。已知有24种主要限制酶在pBR322上都只有一个切点，其中有7种限制酶（EcoRV、NheI、BamHI、SphI、SalI、 XmaIII、 NruI）的切点位于四环素抗性基因之内，还有3种限制酶（ScaI 、PvuI和PstI）的切点位于氨苄青霉素抗性基因之内。外源DNA片段插入这些位

13、点之中任一位点时，将导致相应的抗性基因的失活。这种因外源DNA的插入而导致基因失活的现象，称为插入失活（insertional inactivation）。图10-2 质粒pBR322结构图插入失活常被用于检测含有外源DNA的重组体（图103），例如若在质粒pBR322的BamHI的位点插入外源DNA，然后转化大肠杆菌（Tets、Amps ）。含有重组质粒（即带有外源DNA的质粒）的宿主细胞失去对四环素的抗性，所以不能在含有四环素培养基的平板上生长，但仍能在含有氨苄青霉素培养基的平板上生长。而那些含有不带外源基因的质粒的宿主细胞，则可以在含有四环素或氨苄青霉素培养基的平板上生长，这样就很容易筛

14、选到含有目的基因的细菌，从而淘汰不含目的基因的细菌。图10-3 插入失活示意图3. 其它质粒载体现在已构建许多新的质粒载体 (如pUC系列和pGEM系列的质粒载体)，它们具有更多有用的特点并且使用起来更方便。 这些载体的优点之一，在质粒载体上含有一个人工构建的多接头位点 (polylinker) 或多克隆位点(multiple cloning site)，这是一个带有不同限制酶单一识别位点的短的DNA片段，外源基因可随意插入任何一个切点。同时又由于多克隆位点常位于一个基因的编码区之中，因此，基因的插入失活极易被检测到。除大肠杆菌质粒外，枯草芽孢杆菌质粒也可作为质粒载体之用。此外，酿酒酵母（Sa

15、ccharomyces cerevisiae）的2m m质粒常作为酵母细胞外源基因的克隆或表达载体。为了便于基因工程工作，人们先后构建了一系列不同类型的穿梭质粒载体（shuttle plasmid vector）。这是一类同时含有两种细胞的复制起点（特别是同时含有原核与真核生物的复制起点），能在两种生物细胞中进行复制的质粒载体。其中最为常见和被广泛应用的是大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体，这种质粒同时含有大肠杆菌和酿酒酵母的复制起点，故既可在大肠杆菌细胞中复制又可在酵母细胞中进行复制。此外还有其他穿梭质粒载体系统。二、噬菌体克隆载体噬菌体是基因工程中一类很有价值的克隆载体，具有很多优点：它的分子

16、遗传学背景十分清楚。噬菌体载体的容量较大。一般质粒载体只能容纳10多个kb。而噬菌体载体却能容纳大约23kb的外源DNA片段。具有较高的感染效率。其感染宿主细胞的效率几乎可达100，而质粒DNA的转化率却只有0.1。以上优点为克隆较大片段的外源DNA提供了有利条件，并可大大增加构建基因库的效率。1.噬菌体载体的构建 野生型噬菌体DNA不适于作为克隆载体，因为它的DNA分子很大，基因组结构复杂，限制酶有很多切点，并且这些切点多数位于必需基因之中等等。为了避免上述问题，需经一系列改造。构建噬菌体克隆载体的基本原则是：删除基因组中非必需区，使基因组变小，有利于克隆大的DNA片段。除去多余的限制位点。

17、现已构建了各种各样的载体。这些载体可分为两类：一类称为插入型载体（insert vector）其限制酶位点可用于外源DNA的插入；另一类称为取代型载体（replacement vector）具有成对限制酶位点，外源DNA可取代两个限制位点上的DNA区段。重组DNA与包装蛋白混合，可在体外包装成有感染力的重组噬菌颗粒。虽然噬菌体载体是一类极为有用的克隆载体，但是由于噬菌体头部组装时容纳DNA 的量是固定的，因此插入外源DNA的长度必须控制在使重组DNA为野生型DNA长度的78105之间，否则不能正常组装。三、柯斯质粒载体柯斯质粒载体（cosmid vector）即粘粒载体，是由噬菌体的粘性末端和

18、质粒构建而成。cosmid一词的意思是带有cos位点的质粒。柯斯质粒载体含有来自质粒的一个复制起点、抗药性标记、一个或多个限制酶单一位点，以及来自噬菌体粘性末端的DNA片段，即cos位点。它对于将DNA包装成噬菌体粒子是必需的。柯斯质粒载体的优点：具有噬菌体的高效感染力。而在进入宿主细胞后不形成子代噬菌体仅以质粒形式存在。具有质粒DNA的复制方式。重组DNA注入宿主细胞后，两个cos位点连接形成环状DNA分子，如同质粒一样进行复制。具有克隆大片段外源DNA的能力。这是柯斯质粒的最大优点。柯斯质粒本身一般只有57kb左右，而它克隆外源DNA片段的极限值竟高达45kb，远远超过质粒载体及噬菌体载体

19、的克隆能力。四、M13噬菌体载体M13是大肠杆菌丝状噬菌体，其基因组为环状ssDNA，大小为6407bp。感染雄性（F+或Hfr）大肠杆菌并进入细胞后，转变成复制型 (RF) dsDNA，然后以滚环方式复制出ssDNA。每当复制出单位长度正链，即被切出和环化，并被立即组装成子代噬菌体和以出芽方式（即宿主细胞不被裂解）被释放至胞外。野生型M13不适于作为克隆载体，因此人们对野生型M13进行了改造，构建了一系列M13克隆载体（图10-4）。在M13基因组中，除基因间隔区（IG）外，其他均为复制和组装所必需的基因。外源DNA插入IG区，可不影响M13活动，因此对野生型M13的改造主要在IG区中进行。

20、图10-4 噬菌体载体M13 mp 18 的结构示意图（1） 插入半乳糖苷酶选择标记 在IG区中插入半乳糖苷酶N端一小段编码序列及其调控序列，该序列编码半乳糖苷酶的肽，肽可与大肠杆菌LacZ突变基因M15进行互补，产生具有活性的半乳糖苷酶。若将M13和宿主细胞涂布在含有异丙基硫代-D-半乳糖苷(IPTG)和呈色物质5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷(Xgal)培养基的平板上时，可形成蓝色噬菌斑。（2） 插入一小段多克隆位点区 在肽的编码区内插入一小段密集限制酶单一位点的DNA片段，当外源DNA插入到这一区段，则会破坏互补作用。这时若将M13（含外源DNA）和宿主细胞涂布在含有IPTG和Xg

21、al培养基的平板上，则形成无色噬菌斑。M13载体克隆外源DNA的能力较小，一般只适于克隆300400bp的外源DNA片段，它的突出优点是，特别适合用于制备克隆基因的单链DNA。因此，它主要被用于制备测序用单链DNA模板、特异的单链DNA探针，定位诱变等。也可用于噬菌体展示（phage display）。五、噬菌质粒载体噬菌质粒（phagemid 或phasmid）是由丝状噬菌体和质粒载体DNA融合而成，兼有两者优点，这类载体具有来自M13或f1噬菌体的基因间隔区（内含M13或f1噬菌体复制起点）和来自质粒的复制起点，抗药性标记，一个多克隆位点区等。例如pUC118噬菌质粒载体就是在野生型M13

22、的基因间隔区插入质粒载体pUC18构建而成的。噬菌质粒在寄主细胞内以质粒形式存在，复制产生双链DNA。当用辅助噬菌体M13感染宿主细胞后，噬菌质粒的复制就转变成如同M13噬菌体一样的滚环复制，产生单链DNA并被包装成噬菌体粒子， 以出芽方式释放至胞外。噬菌质粒载体在应用上具有许多优点：载体本身分子小，约为3000bp，便于分离和操作。克隆外源DNA的容量较M13噬菌体载体大，可克隆10kb外源DNA片段。可用于制备单链或双链DNA，克隆和表达外源基因。现将上述几类大肠杆菌克隆载体的克隆能力及其主要用途列表比较（表10-1）表10-1 几类大肠杆菌克隆载体比较载体类型 克隆外源DNA片段大小 主

23、要用途 质粒载体 15kb 克隆和表达外源基因；DNA测序 噬菌体载体 23kb 构建基因文库和cDNA文库 柯斯质粒载体 45kb 构建基因文库 M13载体 300400bp 制备单链DNA；定位诱变；噬菌体展示 六、真核生物的克隆载体以上主要讨论了原核生物的克隆载体。但是关于真核生物基因调控以及真核基因产物转录及翻译后的加工等问题，是原核生物载体所无法解决问题。因此为了适应真核生物基因工程的需要，现已构建了一系列真核生物载体，主要有以下几大类：1.酵母质粒载体 酵母质粒载体都是利用其2?m质粒与细菌质粒pBR322构建而成的，主要有以下三种(图10-5)：图10-5 酵母质粒载体（1）附加

24、体质粒（episomal plasmid）该质粒载体含有来自细菌质粒pBR322的复制起点并携带作为大肠杆菌选择标记的氨苄青霉素抗性基因（Ampr）。此外还有来自酵母2m m质粒的复制起点以及一个作为酵母选择标记的URA3基因（尿嘧啶核苷酸合成酶基因3），这种质粒既可在大肠杆菌中也可在酵母细胞中复制，当重组质粒导入酵母细胞中可进行自主复制，且具有较高拷贝数。（2）复制质粒（replicating plasmid）该质粒含有来自细菌质粒pBR322的复制起点和作为大肠杆菌选择标记的氨苄青霉素抗性基因（Ampr）和四环素抗性基因（Tetr）。还有来自酵母染色体的自主复制序列（ARS），以及作为酵母

25、选择标记的URA3基因和TRP1基因（色氨酸合成酶基因1），故这种质粒是穿梭质粒，能在大肠杆菌或酵母细胞中复制，重组质粒导入酵母细胞中可获得中等拷贝数的质粒。（3）整合质粒（integrating plasmid） 该质粒含有来自大肠杆菌质粒pBR322的复制起点和作为大肠杆菌选择标记的氨苄青霉素抗性基因（Ampr）、四环素抗性基因（Tetr）。以及来自酵母的URA3基因，它既可以作为酵母细胞的选择标记，也可与酵母染色体DNA进行同源重组。这种质粒可在大肠杆菌中复制，但不能在酵母细胞中进行自主复制。一旦导入酵母细胞，可整合到酵母染色体上，成为染色体DNA的一个片段。2.真核生物病毒载体（1）哺

26、乳动物病毒载体 这类病毒载体具有许多突出优点：例如动物病毒能够有效识别宿主细胞，某些动物病毒载体能高效整合到宿主基因组中，以及高拷贝和强启动子等，有利于真核外源基因的克隆与表达。目前利用许多哺乳动物病毒如SV40，腺病毒、牛痘病毒、逆转录病毒等改造后的衍生物作为基因载体。（2）昆虫病毒载体 昆虫中的杆状病毒的衍生物作为载体具有许多优点，主要为高克隆容量，克隆外源DNA片段大小可高达100kb；其次具有高表达效率，外源DNA的表达量达到细胞蛋白质总量的25左右，甚至更多；此外，它具有安全性，仅感染无脊椎动物，并不引起人和哺乳动物疾病。（3）植物病毒载体一些RNA病毒和DNA病毒已被改造为植物基因

27、工程载体。目前植物基因工程操作较多使用双链DNA病毒载体，如花椰菜花叶病毒载体。七、 人工染色体酵母人工染色体（yeast artificial chromosome, YAC）是一类目前能容纳最大外源DNA片段人工构建的载体。它是由默里（Murray）于1983年首次构建成功的。伯克（Burke）等于1987年用以构建成YAC克隆库。酵母染色体的控制系统主要包括三部分：着丝粒（centromere, CEN）它的作用是使染色体的附着粒与有丝分裂的纺锤丝相连，保证染色体在细胞分裂过程中正确分配到子代细胞。端粒（telomere, TEL）位于染色体两个末端，它的功能是保护染色体两端，保证染色体

28、的正常复制，防止染色体DNA复制过程中两端序列的丢失。酵母自主复制序列（autonomously replicating sequence, ARS），其功能与酵母细胞复制有关。酵母人工染色体（图107）除有端粒、着丝粒、自主复制序列等外，还有选择标记基因（如TRP1和URA3等）。图10-7 酵母人工染色体（YAC）YAC克隆外源DNA能力非常大，一个YAC可插入长达100万碱基以上DNA片段。因此YAC既保证所插入外源基因结构的完整性，又大大减少基因库所要求克隆的数目。目前YAC已成为构建高等真核生物基因库的重要载体，并在人类基因组的研究中起着重要作用。除酵母人工染色体外，现已构建细菌人工

29、染色体（BAC）更便于基因工程操作，在人类基因组研究中正被广泛应用。第三节 微生物与基因工程工具酶基因工程操作需要用到一些基本的工具酶。例如在分离目的基因或切割载体时，需利用特异的限制性核酸内切酶对DNA进行准确切割。在构建重组DNA时，需在DNA连接酶的催化下，使目的DNA片段与载体DNA进行连接。此外，重组DNA技术还需要一些其他的工具酶。值得注意的是，基因工程所用到的绝大多数工具酶都是从不同微生物中分离和纯化而获得的。一、限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）或简称为限制性酶（restrition enzyme）是指能识别双链DNA分子的特定

30、序列，并在识别位点或其附近切割DNA的一类内切酶。在细菌细胞内限制性酶与DNA甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，利用限制酶降解进入细胞内的外源DNA，同时用甲基化酶修饰细菌本身DNA，以避免被酶降解。1.限制性内切酶的命名与分类 限制性酶的命名是根据分离出此酶的微生物学名而定的。即取微生物属名的第一个字母和种名的头两个字母组成三个斜体字母加以表示，遇有株名，再加在后面。如果同一菌株先后发现几个不同的酶，则用罗马数字加以表示。例如EcoRI中的E表示大肠杆菌属名第一个字母，co表示种名头两个字母，R表示株名，I表示该菌中第一个被分离出来的酶。如限制酶是来自同一属的细菌，而且种名的头两个字母完全

31、相同，这时其中一个菌的酶命名的第三个字母可用种名的词头后的另一个字母代替。例如副流感嗜血杆菌（Haemophilus parainfluenzae）的酶表示为HpaI 和HpaII；而副溶血嗜血杆菌（Haemophilus parahaemolyticus）的酶表示为HphI。根据限制酶识别和切割DNA的特点，可将限制酶分为I、II、III三种类型，I型和III型由于无切割特异性或特异性不强故不用于基因工程，II型限制酶的限制修饰系统分别由限制酶和修饰酶两种不同的酶组成，仅需Mg2+作为辅助因子，切割位点位于识别位点之内或在附近，特异性最强，用处最大，是基因工程重要工具酶，通常所说的限制性核酸

32、内切酶，即指此类酶。2.限制性核酸内切酶的基本特性 II型限制酶的识别序列通常由48个碱基对组成，他们具有二重旋转对称轴，这些碱基对的序列呈回文结构（palindromic structure）。所有限制酶切割DNA后，均产生含5，磷酸基和3，羟基的末端。限制酶作用所产生的DNA片段有以下两种形式：(1) 形成粘性末端（cohesive end）有些限制酶不在识别序列的对称轴上切割，而是交错切割结果形成的DNA限制片段具有粘性末端。例如HindIII切割结果形成5，单链突出的粘性末端；而PstI切割结果却形成3 单链突出的粘性末端。 （2）形成平末端（blunt end）有些限制酶在识别序列的

33、对称轴上切割，形成的DNA片段具有平末端。例如HpaI切割结果形成平末端。HindIII的识别序列是： HpaI的识别序列是：不同的限制性核酸内切酶识别DNA中的碱基对序列长短不同。在随机排列的DNA序列中，识别位点序列长的限制酶，在酶切后所得到的DNA片段长，相反识别位点序列短的限制酶，酶切后所得到DNA片段短。同裂酶（Isoschizomers） 有些来源不同的限制酶却识别和切割相同的序列，这类限制酶称为同裂酶。同裂酶产生同样切割，形成同样的末端，酶切后所得到的DNA片段经连接后所形成重组序列，仍可能被原来的限制酶所切割。同裂酶之间的性质有所不同（如对离子强度、反应温度以及对甲基化碱基的敏

34、感性等方面可能有所差别）。同尾酶(Isocaudomers) 有些来源不同的限制酶，识别及切割序列各不相同，但却能产生出相同的粘性末端，这类限制酶称为同尾酶。但两种同尾酶切割形成的DNA片段经连接后所形成的重组序列，不能被原来的限制酶所识别和切割。EcoRI 和MunI属于同尾酶。MunI的识别序列是： EcoRI的识别序列和切割位点：表10-2介绍一些常用限制酶的识别序列及其产生菌。表10-2 若干常用限制酶的识别序列及其产生菌限制酶名称 识别序列 产生菌 BamH I GGATCC 淀粉液化芽孢杆菌（Bacillus amyloliuifaciens H） EcoR I GAATTC 大肠

35、杆菌（Eschericha coli Rr13） Hind III AAGCTT 流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae Rd） Kpn I GGTACC 肺炎克氏杆菌（Klebsiella pneumoniae OK8） Pst I CTGCAG 普罗威登斯菌属（Providencia stuartii 164） Sma I CCCGGG 粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens sb） Xba I TCTAGA 黄单胞菌属（Xanthomonas badrii） Sal I GTCGAC 白色链霉菌（Streptomyces albus G） Sph I G

36、CATGC 暗色产色链霉菌（Streptomyces phaeochromogenes） Nco I CCATGG 珊瑚色诺卡代菌（Nocardia corallina） 二、DNA连接酶（DNA ligase）DNA连接酶与限制性内切酶一样，也是由微生物产生。主要来自T4噬菌体和大肠杆菌，也是重组DNA技术中具有头等重要的工具酶，重组DNA技术核心步骤是在体外利用DNA连接酶将目的基因和载体共价连接构成重组DNA分子。目前常用的三种体外DNA连接方法为： 用T4或E.coli DNA连接酶可连接具有互补粘性末端的DNA片段； 用T4 DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段； 先在DNA片段末

37、端加上人工接头，使其形成粘性末端，然后再行连接。DNA连接酶催化两个双链DNA片段相邻的5,端磷酸与3,端羟基之间形成磷酸二酯键。它既能催化双链DNA中单链切口的封闭，也能催化两个双链DNA片段进行连接。DNA连接酶主要有两种：一种是T4 DNA连接酶，另一种是大肠杆菌DNA连接酶。T4 DNA连接酶由一条多肽链组成，分子量为6800，通常催化粘性末端间的连接效率要比催化平末端连接效率为高。催化反应需要Mg2+和ATP，ATP作为反应的能量来源。T4 DNA连接酶在基因工程操作中被广泛应用。大肠杆菌DNA连接酶的分子量为7500，连接反应的能量来源是NAD，此酶催化DNA连接反应与T4 DNA

38、连接酶大致相同，但不能催化DNA分子的平端连接。除上述二种工具酶以外，还有其它重要的工具酶也是来自微生物，如DNA聚合酶I（DNA ploymerase I）、Klenow聚合酶，以及逆转录酶（reverse transcriptase）等。第四节微生物作为克隆载体的宿主为了保证外源基因在细胞中的大量扩增和表达，选择合适的克隆载体宿主就成为基因工程重要问题之一。一、宿主的基本要求与性质 对于克隆基因而讲，一个理想宿主的基本要求是：能够高效吸收外源DNA；具有使外源DNA进行高效复制的酶系统；不具有限制修饰系统（hsd system），故不会使导入宿主细胞内未经修饰的外源DNA发生降解；不具有D

39、NA重组系统，常用重组缺陷型（RecA-）菌株，使克隆载体DNA与宿主染色体DNA之间不发生同源重组；便于进行基因操作和筛选；具有安全性。宿主细胞应该对人、畜、农作物无害或无致病性等。某些工程微生物，如原核生物的大肠杆菌及真核生物的酿酒酵母，由于他们具有一些突出优点如生长迅速、极易培养、能在廉价培养基中生长，其遗传学及分子生物学背景十分清楚等，因此他们已成为当前基因工程被广泛应用的重要克隆载体宿主。二、原核生物宿主 在选择原核微生物作为克隆载体宿主时，还应考虑下列一些问题：首先应根据克隆载体性质以及它们导入细胞的方式选择相应的宿主细胞。例如当选择质粒DNA作为载体并通过转化方式进入细胞，最好选

40、择易于形成感受态细胞的细菌作为宿主，以利于宿主细胞有效吸收外源DNA；又如若选择经体外包装的l 噬菌体载体或柯斯质粒作为克隆载体，并以感染方式进入细胞，则应选择l 的敏感宿主(E.coli k12菌株)作为克隆载体宿主；当用M13衍生物作为克隆载体，则应选择含有F因子的雄性大肠杆菌作为宿主。其次为了便于阳性克隆的筛选，作为克隆宿主的基因型应与载体基因相对应。例如若载体携带氨苄青霉素抗性基因，则相应宿主应该是对氨苄青霉素敏感细菌；若载体携带-半乳糖苷酶-肽的编码序列，那么应选择该基因N端部分编码序列缺失的突变株(Lac ZM15)作为宿主；最后为了安全目的，需严格限制载体的宿主范围，以达到尽量避

41、免重组体从实验室逃逸出去。例如构建的载体中某一重要基因编码序列发生琥珀突变，这时必需选择具有强琥珀突变抑制基因的宿主，重组载体离开该宿主即无法存在。目前几乎所有的有关重组DNA的研究工作均利用大肠杆菌作为克隆基因的宿主，但是存在一些不利之处。首先由于它是条件致病菌，故存在潜在的致病性，即使非致病的菌株仍能产生内毒素，有可能污染表达产物。再有，外源基因的表达产物，易被蛋白水解酶降解或不能正确加工折叠。目前上述多数问题已有办法加以解决。其他细菌，如枯草芽孢杆菌，也已发展成为克隆载体的宿主。它不存在潜在致病性，不产生内毒素，可将蛋白质分泌到培养基中，并且已有合适的质粒载体用于转化。但是枯草芽孢杆菌作

42、为克隆载体也存在不足之处是，它的质粒往往不稳定，经多次传代后，很难保持质粒继续复制，外源DNA不能很好保留在细胞内甚至发生突然丢失。因此，使枯草芽孢杆菌作为克隆宿主的应用受到一定的限制。三、真核生物宿主利用真核生物作为克隆载体宿主具有两个重要意义。第一它促进了对真核生物复杂基因组及其基因调控的研究；第二它有利于真核基因产物的翻译后加工。酿酒酵母是一种理想的真核生物克隆载体宿主。这是由于对其遗传学有较深入的了解；其基因的表达调控以及蛋白质的翻译后加工比较接近高等真核生物；此外它具有较高的安全性，用它表达生物药物时，不需进行大量宿主安全试验。目前已构建了一系列酵母质粒载体及酵母人工染色体。通过转化

43、，可将大片段的外源DNA导入酵母细胞，并得到正确的克隆和表达。它对于高等真核生物基因组及其转录、翻译系统研究提供了一个良好基础。利用哺乳动物细胞进行基因克隆极为重要，有关人类遗传学、肿瘤、感染性疾病和生理学的许多研究均赖以进行。但是哺乳动物细胞作为宿主不利之处是，若要进行大规模细胞培养，则费用过于昂贵和难于操作，同时克隆基因的表达水平也常常是极低的。现在已开发昆虫细胞系作为一种昆虫DNA病毒（杆状病毒）载体的克隆宿主，较易进行大规模的细胞培养。四、外源DNA导入宿主细胞将外源DNA导入宿主细胞是分子克隆关键步骤之一。其导入方式是多种多样的：1. 外源DNA导入原核细胞 外源DNA可通过转化、转

44、染以及感染等方式被导入原核细胞(1) 转化或感染 如果外源DNA以重组质粒载体形式存在，则可通过转化导入原核细胞；如果外源DNA被构建成重组噬菌体DNA或重组噬菌质粒，则可通过转染方式进入宿主细胞。无论转化或转染都需用氯化钙处理宿主细胞,使细胞变得易于吸收外源DNA，这种细胞称为感受态细胞。大肠杆菌转化程序：一般先用一定浓度冰冷的CaCl2溶液处理对数期的大肠杆菌细胞，然后加入外源DNA并短暂给予42热休克处理约90s，使感受态细胞有效吸收外源DNA。一般转化效率可达到每微克DNA转化107108个细胞。(2) 噬菌体的体外包装与感染 如果外源DNA被包装成噬菌体颗粒，则可通过噬菌体感染机制导

45、入宿主细胞。噬菌体DNA体外包装技术是贝克勒(Beckler)和戈尔德(Gold)于1975年最先建立的。体外包装是将重组DNA分子与的头部、尾部以及有关包装蛋白混合，从而组装成完整具有感染力的噬菌体粒子。体外包装的噬菌体用以感染宿主细胞，每微克DNA可产生109的噬菌斑。而如果仅用重组DNA分子通过转染进入大肠杆菌的感受态细胞。则每微克DNA仅能产生104105的噬菌斑，说明感染效率比转染效率要高出104105倍，从而大大提高基因文库的库容量。2. 外源DNA导入真核细胞 外源DNA导入真核细胞方法可因真核细胞种类不同而有所不同(1) 外源DNA导入酵母细胞 一般利用蜗牛酶除去酵母细胞壁形成

46、原生质体，再用CaCl2和聚乙二醇处理，重组DNA以转化方式导入酵母细胞的原生质体，最后将转化后的原生质体置于再生培养基的平板中培养，使原生质体再生出细胞壁形成完整酵母细胞。(2) 外源DNA导入哺乳动物细胞 其中最简便的是微量注射法和电穿孔法。由于有些动物细胞体积较大，如受精卵用微量注射器可将外源DNA注入细胞内。电穿孔(electroporation)法是把宿主细胞与外源DNA混合并置于电击槽中。在高压电脉冲作用下，使细胞膜瞬时击穿出现微孔，外源DNA通过微孔进入细胞。电穿孔法十分成功用于哺乳动物细胞和植物细胞，而且也可用于通常不能进行转化的细菌。大肠杆菌应用电穿孔法也可提高转化率。此外还

47、有磷酸钙共沉淀转染法，DEAE-葡聚糖转染法、聚阳离子转染法、原生质体融合法、脂质体法等。(3) 外源DNA导入植物细胞 除了通过微量注射法及电穿孔法可将外源DNA导入植物细胞外。还有两种方法，一种是将含有重组Ti质粒的土壤农杆菌与植物原生质体共培养（即共培养法）或与植物叶片共培养（即叶片培养法），多数双子叶植物转化常用此法；另一种是基因枪法或称微弹枪（particle guan）法，利用微弹把表面吸附有外源DNA的金属微粒高速射进植物的细胞或组织，可直接将外源基因导入幼苗，此法简便、有效。故颇受欢迎和被广为应用。五、基因文库与cDNA文库的构建 利用重组DNA技术，可将某一原核生物或真核生物

48、染色体基因组的全部遗传信息，贮存在由重组体群体（如重组噬菌体群体）构成的基因文库(genomic library)或cDNA文库(cDNA library)之中，就好像将文献资料贮存于图书库一样。以供长期贮存和随时钓取克隆基因使用。1. 基因文库的构建由于高等生物染色体基因组结构复杂，分子庞大，而单个基因却只占染色体DNA的很小部分。若要从巨大染色体基因组中分离某一目的基因，通常需经过两个步骤：首先构建一个基因文库，然后根据目的基因的性质或序列从基因文库中筛选出来。所谓基因文库是指生物染色体基因组各DNA片段的克隆总体。文库中的每一个克隆只含基因组中某一特定的DNA片段。一个理想的基因文库应包

49、括该生物染色体基因组全部遗传信息（即全部DNA序列）。基因文库构建的简单步骤（图10-7）：从组织或细胞提取基因组DNA。用限制性酶部分水解或机械剪切成适当长度的DNA片段，经分级分离选出一定大小合适克隆的DNA片段。选择容载量较大的克隆载体，通常采用l 噬菌体或柯斯质粒载体，在适当位点将载体切开。将基因组DNA片段与载体进行体外连接。重组体DNA直接转化细菌或用体外包装的重组l 噬菌体颗粒感染敏感细菌细胞。最后得到携带重组DNA的细菌群体或噬菌体群体即构成基因文库。图10-7 基因文库构建示意图2. cDNA文库构建所谓cDNA文库是指生物体全部mRNA的cDNA克隆总体。cDNA文库中的每

50、一个克隆只含一种mRNA信息。如上所述由于真核生物基因组十分庞大，因此要求构建基因文库的库容量要足够大，才能筛选到某一目的基因。但基于这样一个事实，即细胞中的mRNA分子数要比基因组的基因数小得多（通常大约仅有15%左右基因被表达），因而若由mRNA逆转录为cDNA，那么所构建的cDNA文库的库容量相应比基因文库小。构建cDNA文库的主要步骤（图10-8）：从生物体或细胞中提取mRNA。利用逆转录酶以寡聚(dT)或随机寡聚核苷酸为引物合成cDNA的第一条链。利用DNA聚合酶I，以cDNA第一条链作为模板，用适当引物合成cDNA第二条链。常用RNA酶H在杂交分子的mRNA链上造成切口和缺口，产生

51、一系列RNA引物；或是除去杂交分子的mRNA后，加入随机引物，即可合成第二条链。cDNA与载体的体外连接。噬菌体的体外包装及感染或质粒的转化。由于cDNA不含基因的启动子和内含子，因而序列比基因短，其克隆载体可选用质粒或病毒载体。cDNA文库对克隆和表达真核生物基因更加重要。因为真核生物的基因含有内含子，在原核生物细胞中不能表达，但筛选到的cDNA克隆只要附上原核生物的调节和控制序列，就能在原核细胞内表达。此外，cDNA还代表了基因组表达的遗传信息。图10-8 cDNA文库构建示意图六、重组体的筛选与鉴定在构建文库之后，就需要从众多的克隆中，筛选出含有目的基因的重组体，并鉴定其正确性。概括起来

52、通常有三类鉴定方法，一是重组体表型特徵的鉴定。二是重组DNA分子结构特徵的鉴定。三是外源基因表达产物的鉴定。1. 重组体表型特征的鉴定(1) 抗生素平板法 如果外源DNA片段插入载体的位点位于抗生素抗性基因之外，将转化后的重组体细胞置于含有该抗生素的培养基平板上进行培养，仍可长出菌落。此外，还有一些自身环化的载体和未被酶解的载体，他们的转化细胞也能在含该抗生素平板上生长并形成菌落，而只有作为对照的受体细胞不能生长。此法缺点是假阳性率高。(2) 插入失活法 见第二节图10-3。(3) 插入表达法 在某些载体的标记基因前面连接一段负控制序列，当外源DNA片段插入该负控制序列中，使负控制序列失活，因

53、而位于下游的标记基因因解除阻遏而得到表达。例如质粒pTR262有一个负调控的cI基因，当外源DNA片段插入cI基因中的BcII或Hind III位点，造成cI基因失活，位于cI基因下游的Tet基因（受cI基因控制）因解除阻遏而被表达，转化后的重组体细胞，在含有四环素的平板中可形成菌落；而未被酶解的质粒，自身环化质粒的转化细胞及未转化受体细胞均不能形成菌落。(4) -半乳糖苷酶显色反应法 在某些载体如M13噬菌体载体，pUC质粒系列、pGEM质粒系列，它们的载体上都携带lac z基因一段序列，它编码-半乳糖苷酶的肽，而宿主细胞为lac zM15的突变株。当将上述载体的转化细胞培养在含有X-gal

54、和IPTG平板中，由于基因内互补作用，产生有生物活性的-半乳糖苷酶，把培养基中的无色X-gal分解成半乳糖和呈蓝色的5-溴-4氯-靛蓝，使菌落呈蓝色。若将外源DNA插入到载体上lac z 序列中，使-肽基因失活，失去互补作用，将重组体转化细胞培养在含有X-gal-IPTG平板上，菌落无色。利用-半乳糖苷酶显色反应即可挑选出含有外源DNA重组体的阳性克隆。2. 重组DNA分子结构特征的鉴定(1) 菌落（或噬菌斑）原位杂交(in situ hybridization) 将转化细胞培养在琼脂平板上，当形成菌落或噬菌斑后，再将硝酸纤维滤膜贴在平板上，使菌落或噬菌斑转印到硝酸纤维滤膜上。翻转此滤膜并置于

55、另一不含菌的平板上培养，培养后的滤膜上可长出菌落或噬菌斑。取出滤膜，用裂解液处理使菌体裂解，释放出DNA。再用碱处理，使DNA变性，经烘烤将变性DNA固定于滤膜上。然后用放射性同位素标记的核酸探针进行分子杂交，并经放射自显影，黑点代表杂交上的菌落，即可筛选到阳性克隆。通常影印的滤膜必须有双份，在一张滤膜上找到阳性克隆后，可在另一张滤膜的相应位置上找到活的细菌或噬菌体克隆。此法优点可在短时间内从成千上万克隆中快速筛选到阳性克隆。(2) 内切酶图谱鉴定 将初步筛选的阳性克隆小量培养后，提取重组质粒或重组噬菌体DNA，用1至2种内切酶酶切，然后进行凝胶电泳，检测插入DNA片段大小。(3) PCR鉴定

56、 通过与插入片段两侧互补的引物，以重组质粒DNA作为模板进行PCR分析，可快速测出插入DNA片段大小及鉴定其序列特异性。(4) DNA序列测定 最后为了确证目的基因序列的正确性，必须对重组体的DNA进行序列测定。3. 外源基因表达产物的鉴定(1) 表达产物免疫活性测定 如果表达产物是一种蛋白质或蛋白质的一部分，它具有抗原性可与其特异抗体发生免疫反应。此法实验操作极似菌落（或噬菌斑）原位杂文。将平板上的克隆转移到滤膜上，处理滤膜使菌体裂解，释放出蛋白质，固定于滤膜上，加入标记抗体。如果抗体用放射性同位素标记，则免疫反应后进行自显影；若加入的抗体用酶偶联（酶标），那么此酶就可将无色底物水解成有色产

57、物。(2) 表达产物生物活性检查 可根据表达产物不同情况采用不同方法检测其生物活性。若表达产物是一种酶，则可测定其酶活性；若所表达蛋白质是一种酶的抑制剂，则可测定其抑制酶活性能力的大小等等。(3) 表达产物氨基酸序列测定测定表达产物“N”端氨基酸序列，对表达产物的鉴定具有特别重要意义。第五节表达载体的构建基因工程的主要目的是使外源基因能在细菌、酵母或动、植物细胞中得到高效表达，以便获得大量有益的基因表达产物或改变动、植物遗传性状。 所谓表达载体(expression vector)是指具有宿主细胞基因表达所需调节控制序列，能使克隆的基因在宿主细胞内转录和翻译的载体。也就是说，克隆载体只是携带外源基因，使其在宿主细胞内扩增；表达载体不仅使外源基因扩增，还使其表达。原核生物和真核生物的表达载体有一些共同的要求。但是原核生物和真核生物的基因表达调控机制有很大不同，故需要分别采用原核生物和真核生物的调控元件来构建。当真核生物基因在原核细胞中表达时，表达产物有两种形式，一种是非融合蛋白，另一种是融合蛋白。两种形式各有利弊，在进行基因工程时可根据具体情况进行设计。一、表达系统的要求与主要调控元件 真核细胞基因在原核细胞