低密度脂蛋白胆固醇测定方法研究进展

1、    低密度脂蛋白胆固醇测定方法研究进展             作者：佚名时间：2007-11-23 10:32:00                      摘要 血清或血浆中低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）与冠心病（CDH）发生和

2、动脉粥样硬化损伤呈正相关，而且是美国国家胆固醇教育计划（NCEP）作为脂类疾病分类和风险预测的一个重要指标。LDL-C也是选择药物治疗和预后方面的一个十分有意义的临床指标，国内外都在研究和开发行之有效、可靠的标准化测定方法。本文对其有关的测定方法和研究进展作综述。 关键词：低密度脂蛋白胆固醇；方法学；心血管疾病 临床和流行病学研究证明血清中LDL-C与冠状动脉粥样硬化有密切的正相关1。在1986年病理学家们就研究证明LDL-C浓度越高时动脉粥样硬化损伤的程度越大，粥样硬化程度小时，测到血清中LDL-C也低2,3。 lDL是一组不均一的脂蛋白颗粒，一般认为LDL的漂浮密度为1.0061.063，

3、且包括了中间密度脂蛋白（LDL）1.0061.019及Lp(a)1.0501.080。LDL中蛋白含量约为2025，主要是载脂蛋白B-100（ApoB-100），而载脂蛋白E（ApoE）和载脂蛋白C（ApoC）含量很少。胆固醇的含量约是血清中总量的三分之二。LDL是通过受体途径进行降解，如过量时可以导致巨噬细胞和其他吞噬细胞变成泡沫细胞，这被认为是与动脉粥样硬化有关的因素。因此，LDL-C的测定结果直接影响到分类和治疗。美国的NCEP专家组以LDL-C浓度将成人、小孩、青少年各分为：成人在3.37mmol/L(1300mg/L)以下为合适水平，在3.374.12mmol/L(13001590m

4、g/L)间作为中危水平，高于4.14mmol/L(1600mg/L)时作为高危水平；小孩和青少年在2.85mmol/L(1100mg/L)以下为合适水平，在2.853.34 mmol/L(11001290mg/L)为中危水平，高于3.37mmol/L(1300mg/L)为高危水平4。为提高LDL-C测检水平，国内外对LDL-C测定方法进行广泛的研究并不断改善，现将有关方法研究进展综述如下： 1 等密度和密度梯度超速离心法 血清中的各种脂蛋白的分离是LDL-C测定的一个重要环节。由于各种脂蛋白的大小、密度和组成及功能都有很大的不同。超速离心技术就是利用脂蛋白各种成分的密度不同将它们分离，是脂蛋白

5、分离的主要方法。 1950年Delalla和Gofman首次报道等密度超速离心法。在实验室中一般采用Quantification（Q）法，它利用1.006的临界分离液，在离心力为10900g时离心18h，将血浆分成上下两部分，上清液为VLDL和乳糜颗粒，下面为IDL、LDL和HDL。用试管切开技术将上下液体分开。下面部分再采用化学沉淀法将HDL和LDL及IDL分开，分别用酶法测定胆固醇。这方法已被临床实验室作为参考方法。而且还可以根据需要改变分离液密度，当密度提高为1.019，可以将IDL与LDL和HDL分开，也可提高到1.21，分离出HDL等。但在选择脂蛋白分离切点系指它们与缓冲液混和物的密

6、度，而不是脂蛋白自身的密度。 另外有报道用密度梯度超速离心法5。这种方法是将血清加入到已有不同密度梯度的分离液中，进行超速离心后，血清中脂蛋白的各种成份可以转移到各自相等密度的相等的区域。这种方法可以一次将脂蛋白中的各种成份分离。而不足之处是要求离心时间很严格，分开各种组份较困难。根据离心转子的不同，可以分为水平转子，垂直转子以及固定角度转子。水平转子在实验中已被证明分离效果最好，但要求离心时间长（1766h）；垂直转子可以缩短时间（45min3h），由于转动距离小，会有微量丢失；在等密度超速离心中首选固定角度转子，如在密度梯度超速离心中使用时，离心时间要比垂直转子稍长。 这两种方法对实验室要

7、求条件高，一般实验室都难以应用。虽然现在有很多改良方法，克服了传统方法的部分缺点，但分离的效果仍不能同传统方法比。所有的超速离心法都有它们的局限性，它们所测得的结果仍是NCEP作为分类和治疗的指标。 2谱法 根据脂蛋白分子的大小和亲和性有很大的不同，利用层析技术对脂蛋白进行分离。目前有多种色谱仪和分离柱被用 于脂蛋白的分离。而琼脂糖层析技术和Toya soda的高压凝胶层析技术使用最普遍。这种方法是非破坏性，可以回收各种成份，有报道6LDL-C的回收率可以达到8098，但稳定性较差。目前这种技术也在不断完善，但要求实验条件高，操作繁琐，时间长，仪器昂贵，难以在临床实验室应用。 3电泳 电泳技术

8、是基于脂蛋白分子所带的电荷和分子量大小不同进行分离，早期这种技术在临床实验室普遍用于定性分析，直接观察血清脂蛋白谱。现在已不再推广使用，大量实验证明电泳电量法所得的结果不能令人满意，并且发现与常规实验测得的结果有误差。有报道7肝硬化胆道阻塞病人的血清脂蛋白谱显示正常，而血清胆固醇浓度追忆忼于25.9mmol/L(10g/L)。因此还应进行总胆固醇（TC）测定。因为亲脂性染料不能和游离胆固醇以及磷脂结合。另外，可以与超速离心法和化学沉淀法联合使用，经分离后，进行某一组份纯度分析。免疫与电泳技术结合，可以大大提高准确度；以及全自动电泳分析仪出现，在常规实验室进行脂蛋白定量分析将成为可能。 4化学沉

9、淀法 4.1肝素沉淀法肝素在pH值5.12柠檬酸缓冲液中可以沉淀LDL，使LDL与其它脂蛋白分离，然后进行胆固醇测定。这种方法pH值很重要。pH值必须使LDL颗粒的脂蛋白所带电荷刚为正值。由于VLDL和LDL等电点分别为4.7和5.4，pH值5.12±0.02时LDL刚好可以完全沉淀，而VLDL不沉淀。肝素沉淀法与定量电泳法有很好的一致性，但当TG含量大于4.58mmol/L(4000mg/L)时，一致性相对降低。在型血浆脂蛋白增高症的病人血清中加沉淀剂时VLDL和Lp(a)与LDL发生共同沉淀，导致结果出现偏差。这种方法在TG低时，它有很好的精密度，变异系数小于3.5。与等密度超速

10、离心法比较，当TG浓度大于2.0mmol/L(1750mg/L)时，肝素法出现结果偏离4。近年Armstrong等8实验证明降低pH值到4.85时Lp(a)沉淀。 4.2聚乙烯硫酸（PVS）沉淀法含有EDTA的PVS可将血清中LDL沉淀。PVS沉淀LDL是非离子相互作用，pH值影响较小，pH值在38范围内均可以沉淀。因此，并不需要精确的pH值。沉淀剂中EDTA与血清中二价离子结合，阻止VLDL共同沉淀，而聚乙二醇独甲醚（PEGME）加速LDL形成小球，可缩短沉淀时间。Assmann等9实验证明PVS法可以将LDL同HDL、VLDL和LpX分离，但Lp(a)则完全同LDL共同沉淀，实际结果应包括

11、Lp(a)所含的胆固醇。当血清中TG浓度小于4.2mmol/L（3680mg/L）时，与超速离心法有很好的一致性，但当TG大于4.6mmol/L(4070mg/L)时，PVS法所得结果偏低，且随TG浓度的升高误差也随着增大。当血清TG低时，PVS法与其它所有方法都有很好的一致性，且有好的精确度，变异系数小于3.0。 4.3 多环表面活化法 本法采用pH值6.10的异吡唑缓冲液中非特异两歧性聚合物使LDL沉淀，然后将沉淀物重新溶解直接测定LDL-C或有TC与上清液胆固醇之差计算出。Moss等报道10此法与超速离心法和电泳法有很了的一致性，但与其他化学沉淀法一样受血清中的TG浓度影响。 5Frie

12、dewald公式计算法 1972年Friedewald和Levy等首次提出用公式计算：LDLCTC(HDLCVLDLC），而VLDLCTG×0.45(mmol/L)或VLDLCTG×0.20(mg/L)。此公式是基于TG和比率恒定的情况与其它方法有很好的相关性，并要求空腹血清。如型血浆脂蛋白增高症的病人血清VLDLC/TG变化很大，且TC、TG、HDLC测定结果的准确性直接影响到LDLC结果。如血活中TG升高时，LDLC结果偏低，型血浆脂蛋白增高症病人的LVDLC/TG的比率高达到0.947(mmol/L)11,12。因此此公式在临床上的运用要求血清TG的浓度小于4.52m

13、mol/L(4000mg/L)，否则会提供    错误结果，会对分类和治疗作出误导。 6免疫结合分离法 这种方法根据血清脂蛋白中 所含有载脂蛋白的种类和数量的差异，制备有关载脂蛋白的抗体，通过免疫结合，达到相应物质的沉淀，得到所需的结果。由于LDL含绝大部分ApoB-100，达到98；而ApoA-I和apoE却很微量。1993年Leary等13提出采用羊的多克隆抗Apo-A1和ApoE血清与乳胶颗粒结合，形成致敏剂，然后与脂蛋白的VLDL、HDL、IDL、乳糜颗粒等结合沉淀，分离出LDL并用酶法测定胆固醇。与Q法作比较，空腹和非空腹血都有很好的一致性，相

14、关系数分别为0.96和0.98，日内变异系数小于3，日间变异系数小于4，后来Castellani等14采用Sigma提供的试剂进行实验，结果TG高于4.29mmol/L(3800mg/L)和HDL-C2.55mmol/L(990mg/L)时不影响LDL-C结果。而McNamara等15则认为上清液放在-80冰冻时间越长，结果变化越大，如放置26周后，结果改变达-13.66±5.35%。而Pisani等16采用200l试剂加入30l血清或血浆旋转混匀，在室温放置510min，离心分离上清液作LDL-C测定。且用本方法和Q法分别对177份血清进行测定，两方法的相关系数为0.980；分别对

15、29份甘油三酯高于4.52mmol/L(4000mg/L)的血清进行测定。相关系数为0.927。本方法有很好精密度，日内和日间变异系数均小于3%。这种方法不要求用空腹血清，而且对高乳糜微粒血症、高TG血症和型血浆脂蛋白增高症病人血清一样可以精确测定。这种方法被美国NCEP专家们推荐为常规实验室测定的方法。 由上可知，目前测定LDL-C的各种方法仍存在各自的优缺点，密度梯度超速离心法仍是目前认定的参考方法，国外也有把等密度超速离心法和化学沉淀法相互结合的Q法作为金标准。化学沉淀法设备简单。较易开展，但它们共同的一个特点，结果的准确度与TG的水平有关，而且分离不够完全。Friedewald公式计算

16、法，要求空腹血清，且血清的TG、乳糜微粒浓度低时结果才能可靠。近年还有报道17此公式还受其它疾病的影响，化学沉淀法和Friedewald法得到LDL-CA结果，还包括Lp(a)-C的浓度，近年有报道18LDL-C和Lp(a)是反映血管疾病的两个独立因素，并提出应分别测定，让LDL-C和Lp(a)各自更好提供冠心病以及动脉粥样硬化的临床意义。免疫结合分离法是上述各种方法中一种操作和设备都较简便的方法，不受血清的来源和血清中TG、乳糜微粒以及其它疾病的干扰，结果可靠适合于一般实验室使用，在国外已有试剂盒提供，国内由于试剂原因，还有待进一步实验推广。 参考文献 1 backorilk PS.Ross

17、 JW.Clin,1995;41(10):1414 2李健斋，陈曼丽，马正中，等。中华心血管病杂志，1996；24（4）：278 3俞纯山。中国实验诊断学杂志，1997；1（6）：13 4 rifai N,Warnick GR,McNamara JR,et al.Clin Chdm,1992;38(1):150 5 belcher JD,Egan JO,Bridgman G,et al.J Lipid Res,1991;32(2):359 6 rudel LL,Marzetta CA,Johnson FL,et al.Methods Enzymol,1986;129(1):45 7 levy

18、RL.Clin Chen,1981;27(4):653 8 armstrong VW,Werner PS,Eisenhauer,et al.Clem PhysLipids,1994:67-68:315 9 assmann G,Jabs H,Kohnert  U,et al.Clin Chim Acta,1984;140:77 10 moss MA,Wong CSY,Tan MH,et al.Clin Chem,1986;32(6):1096 11 mc Namara JR,Cohn JS Wilson PW,et al.Clin Chem,1990;36(1):36 12 warnick GR,Knopp RH,Fitzpatrck V,et al.Clin Chem,1990;36(1):36 13 leary ET,Tjerslard G,Warnick GR,et al.Clin Chem,1993;39(6):1124 14 castellani WJ,Ghadiali M.C