PCR-SSCP简介及应用

1、PCR SSCP技术综述摘要：聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)是基于PCR 的单链构象多态性分子标记技术。PCR-SSCP作为检测基因突变的方法，自创立以来，经历了自身发展和完善的过程。刚建立时是将同位素掺入PCR扩增物中，通过放射自显影来显示结果，这给该技术的推广造成一定的困难。随着DNA银染方法与PCR-SSCP结合，尤其是直接溴乙锭染色方法的应用，使得该方法大大简化，操作更为简单，局限性较小，实验条件要求不高，适合一般临床实验室使用，具有简便、快速、灵敏的特点。不但被用于检测基因点突变和短序列的缺失和插入，而且还可用于动物育种，微生物，寄生虫研究的多个领域。由于SSCP的

2、突出的优点，近几年被大量地应用。文章介绍PCR-SSCP的原理和方法，优点与缺点，技术的优化和应用级展望。关键词：PCR-SSCP；原理；方法；优缺点；展望Abstract：Polymerase chain reaction - single strand conformation polymorphism (PCR-SSCP) is a PCR-based single-strand conformation polymorphism molecular markers. PCR-SSCP as a method to detect gene mutations, since its inc

3、eption, has experienced its own development and improvement process. When is the isotope incorporation newly created objects in the PCR amplification, by autoradiography to show results, which may cause some difficulty to the promotion of the technology. Silver staining DNA with PCR-SSCP method bind

4、ing, especially as a direct method of staining with ethidium bromide so that the simplified method, the operation is simpler, less limitations, the experimental conditions do not ask for general clinical laboratory use, with simple, rapid, sensitive features. Not only is used for detection of gene d

5、eletions and point mutations and insertion of short sequences, but also for animal breeding, microbes, parasites research in many fields. As the outstanding advantages of SSCP, are extensively used in recent years. This paper introduces the principles and methods of PCR-SSCP, advantages and disadvan

6、tages, optimization, and application-level prospect technology.Key word：PCR-SSCP; Principles; method; advantages and disadvantages; outlook基因单核苷酸多态性(SNP)是指基因组中单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性。包括单碱基的转换、颠换、插入及缺失等形式。DNA分子标记是以个体间核苷酸序列变异为基础的遗传标记。是DNA水平遗传变异的直接反映。通过对分子标记的深入研究。还将最终达到在DNA水平上直接操纵有益基因的目的。在分子遗传标记中，单链构象多态性(Si

7、ngle-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)技术是最常用的方法之一。它是随着对人类基因组的研究而发展起来的用于检测碱基突变的技术。1 聚合酶链反应（PCR） Polymerase Chain ReactionPCR技术诞生于1985年，美国Cetus公司人类遗传室的Kary MullisPCR技术发明者，因此获1993年诺贝尔化学奖1。1.1 基本原理：在反应温度为90-95时，DNA变性成为单链；反应温度降至45-65时，两种引物与两条单链DNA退火而配对结合；反应温度升至72左右时，在TaqDNA聚合酶作用下，引物以单链DNA为模板逐步延伸成新的单

8、链。“ 变性退火延伸”这一循环完成后，DNA复制了一次，由一个DNA分子成为两个DNA分子。1.2 PCR两个重要特性：能合成DNA的特定序列；特定序列的大量扩增变性复性的过程1.3 PCR反应组成：Temple DNA、Primer、 4´dNTPs、DNA Taq酶、PCR Buffer引物：是指两段与待扩增靶DNA序列侧翼片段互补的寡核苷酸。长度一般在20-30mer2 PCR-SSCP方法的原理PCRSSCP是一种以PCR为基础。基于DNA构象差别而进行快速、灵敏、有效检测基因点突变的方法。其基本原理是经PCR扩增的DNA片段在变性剂或低离子浓度下。经高温处理使之解链并保持在

9、单链状态下，DNA单链可折叠成一定空间构象。在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时。相同长度DNA单链因其碱基序列不同。甚至单个碱基不同，导致形成的构象不同，而且单链DNA构象的变化很可能引起了迁移率的改变。每条单链处于一定的位置，靶DNA中若发生碱基缺失、插入或单个碱基置换时，就会出现泳动变位，通过显色或显影后在凝胶上就会显示出带型的差别，即多态性。3 PCR-SSCP的实验操作2在小于1Kb长度的情况下，DNA片段长度与丙烯酰胺的浓度选择如下:DNA片段长度(核苷酸数)丙烯酰胺(%)1Kb700b3.5700b500b5500b200b8200b12在进行SSCP前首先要通过PCR扩增出

10、特异性好的产物(琼脂糖电泳不能有过强的拖尾)。3.1制备聚丙烯酰胺凝胶(PAG) 3按上表制所需的胶液，将梳子插入模子，从梳子一端加入胶，当胶液快到梳齿时，使 模子向加胶端倾斜，继续慢慢加胶，边加边放端模子以防止气泡形成，室温放置1h使 之凝固.然后拔掉梳子，顶部加入1×TBE封闭，备用。3.2电泳取10lPCR产物，加入10l变性剂(95%甲酰胺，10mmol/LEDTA，0.02%溴酚蓝)、30l 石蜡油，煮沸5min，取出立刻放入冰浴中2min以上，然后将水相全部上样，10-15下 电泳.开始在300V电压下电泳5min，然后在120V电泳8h，取下凝胶，将其浸在含 0.5ug

11、/ml溴化锭的1×TBE缓冲液中染色30-45min，在紫外灯下观察，或进行银染。3.3银染法将PAG板用去离子水洗二次，浸入10%乙醇和0.5%冰醋酸溶液固定6min.用去离子水洗 二次，再浸入0.2%AgNO3溶液中10min.用去离子水洗3-5次，然后浸入1.5%NaOH和 0.4%甲醛溶液中显色7min.最后，用0.75%NaCO3终止显色。4 PCR-SSCP的优缺点4PCR-SSCP作为检测基因突变的方法，经不断地改进和完善，变得更为简便、快速、灵敏、不需要特殊的仪器，适合临床实验的需要，适于大样本筛选。因而具有一定的推广价值。4.1 优点4.1.1 可以检测任何(包括已

12、知的和未知的)DNA位点上的多态性和突变，且检测灵敏性高，能够检测出lbp的小缺失和点突变，这大大提高了基因突变的检测范围。4.1.2 无需事先知道待测DNA片段的序列。只要能够根据已有的数据设计PCR引物即可进行PCR- SSCP分析。4.1.3 省去了酶切消化以及核酸杂交等复杂的实验步骤，操作简单，不需特殊仪器，技术容易常握，实验成本低，操作步骤少，周期短，整个过程可在一到两天内完成。4.1.4 可在测序前对DNA样本进行筛选，适合于同时对大量样品进行筛选，特别适用于混合细胞群体中DNA变异的检测。常规方法在研究基因突变时需DNA测序，SSCP技术在测序前对DNA 样本进行筛选，从而大大地

13、避免了盲目测序时带来l 一人力、物力和时间上的浪费。4.1.5 更适宜于对功能基因进行研究。这对动物的功能基因定位有重要意义。4.1.6 PCRSSCP分析对DNA原始材料纯度要求不高。且所需量较少，为该技术在研究和实际操作中的应用提供了极大方便 。4.2 缺陷因为PCR-SSCP技术是新近发展起来的一种分子生物学分析方法。所以不可避免会存在一些缺陷。4.2.1 不能对DNA序列变异进行精确的定位。而只能对其进行初筛，需要结合序列分析才能确定变异的置及内容。对大于300bp的DNA片段，随着DNA片段长度的增加，检测的敏感性逐渐降低。4.2.2 虽然从理论上讲PCR-SSCP法可以检测任何位点

14、上的碱基变异，但实际应用中可能会遇到相当比例的假阴性结果。在通常的条件下，有些突变可能未被检出，因而，只通过该技术并不能证明完全没有突变。4.2.3 PCR-SSCP分析结果受多种因素如电泳温度、离子强度(即电泳缓冲液浓度)、凝胶浓度、甘油的浓度和交联剂亚甲基双丙烯酰胺的浓度等的影响。不同的实验条件甚至可能导致完全不同的结果。在室温，通风冷却条件下电泳，少量片段的条带难以分离。尽管如此，该方法和其他方法相比仍有较高的检测率。首先，它可以发现靶DNA片段中未知位置的碱基突变。Havashi5经实验证明小于300bp的DNA片段中的单碱基突变，99可通过SSCP发现，对于300450bp片段的灵敏

15、度为89 ，因此他认为现在知道的所有单碱基改变绝大多数可用该方法检测出来。另外，SSCP方法可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同迁移率的突变单链DNA分离。并且还可以进一步提纯，用这种方法可以最终从DNA序列水平上鉴别突变DNA片段。再者，PCR-SSCP能灵敏地检测出基因中任何部位导致DNA构象改变的突变基因。为检测某个全长基因的多态性提供了有效方法。借助已构建的物理图谱和遗传图谱，该技术可将更多的位点纳人连锁、数量性状位点(QTL)分析和标记辅助选择分析中。5 SSCP5.1的原理及特点6日本Orita等研究发现，单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互

16、作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同。因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开。作者称该方法为单链构象多态性 (Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)分析。在随后的研究中，作者又将SSCP用于检查PCR扩增产物的基因突变，从而建立了PCR-SSCP技术，进一步提高了检测突变方法的简便性和灵敏性。其基本过程是：PCR扩增靶DNA；将特异的PCR扩增 产物变性，而后快速复性，使之成为具有一定

17、空间结构的单链DNA分子；将适量的单 链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分析结果。若发现单链DNA带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构象发生改变，进而推断该DNA片段中有碱基突变。该方法简便、快速、灵敏，不需要特 殊的仪器，适合临床实验的需要。但它也有不足之处.例如，只能作为一种突变检测方法，要最后确定突变的位置和类型，还需进一步测序；电泳条件要求较严格；另外，由 于SSCP是依据点突变引起单链DNA分子立体构象的改变来实现电泳分离的，这样就可能会出现当某些位置的点突变对单链DNA分子立体构象的改变不起作用或作用很小时，再加上其他条件的

18、影响，使聚丙烯酰胺凝胶电泳无法分辨造成漏检，尽管如此该方法和其他方法相比仍有较高的检测率。首先，它可以发现靶DNA片段中未知位置的碱 基突变。Takao，经实验证明小于300bp的DNA片段中的单碱基突变，90%可被SSCP发现，他认为现在知道的所有单碱基改变绝大多数可用该方法检测出来。另外，SSCP方法可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同迁移率的突变单链DNA分离，并且还可以进一步提纯，用这种方法可以最终从DNA序列水平上鉴别突变DNA片段。5.2 SSCP的不断改进7SSCP技术自创立以来，经历了自身发展和完善的过程，刚建立时是将同位素掺入PCR 扩增物中，通过放射自显影来显示结果。这给该技术的

19、推广造成一定的困难，随着DNA 银染方法与PCR-SSCP结合，尤其是直接溴乙锭染色方法的应用，使得该方法大大简化。最近，SSCP值得注意的改进是将DNA-SSCP分析，改为RNA-SSCP分析，其基本原理是：RNA有着更多精细的二级和三级构象，这些构象对单个碱基的突变很敏感，从而提高了检出率，其突变检出率可达90%以上。另外，RNA不易结合成双链，因此可以较大量的进行电泳，有利于用溴化乙锭染色.但该方法增加了一个反转录过程；还需要一个较长的引物，内含有启动RNA聚合酶的启动序列，从而相对地增加了该方法的难度。为了进一步提高SSCP的检出率，可将SSCP分析与其它突变检测方法相结合。其中与杂交

20、双链分析(Heterocluplex analysis，Het)法结合可以大大提高检出率。Het法是用探针与要检测的单链DNA或RNA进行杂交，含有一对碱基对错配的杂交链可以和完全互补的杂交链在非变性PAG凝胶上通过电泳被分离开。对同一靶序列分别进行SSCP和Het 分析可以使点突变的检出率接近100%，而且实验简便。5.3 SSCP注意的事项8SSCP是一种快速、简便、灵敏的检测基因突变的方法，为了使SSCP达到最佳效果，应 注意下列事项。5.3.1重复性：影响SSCP重复性的主要因素为电泳的电压和温度，这两个条件保持不变， SSCP图谱可保持良好的重复性。一般SSCP图谱是二条单链DNA带

21、，但有时有的DNA片段 可能只呈现一条SSDNA带，或者三条以上，这主要是由于两条单链DNA之间存在相似的立体构象。有时三条以上的SSCP图谱是由于野型DNA片段和突变型DNA片段共同存在的结果。5.3.2靶DNA序列长度的影响在实验中发现SSCP对短链DNA或RNA的点突变检出率要比长链的高，这可能是由于长链DNA和RNA分子中单个碱基的改变在维持立体构象中起的作用较小的缘故.而有人认为在DNA链较短的(400bp以下)情况下，DNA的长度不会影响SSCP 的效果。他们仔细选择了实验条件，发现354bp的DNA中点突变的检出率仍可达到90%以上。5.3.3电泳电压和温度的影响:为了使单链DN

22、A保持一定的稳定立体构象，SSCP应在较低温度下进行(一般4-15之间).在电泳过程中除环境温度外，电压过高也是引起温度升高的主要原因。因此，在没有冷却装置的电泳槽上进行SSCP时，开始的5min应用较高的电压(250V)，以后用100V左右电压进行电泳。这主要是由于开始的高电压可以使不同立体构象的单链DNA初步分离，而凝胶的温度不会升高，随后的低电压电泳可以使之进一步分离。在实验中应根据具体实验条件确定电泳电压。5.3.4 DNA片段中点突变的位置对SSCP的影响点突变在DNA和RNA中的位置对SSCP检测率的影响，取决于该位置对维持立体构象作用的大小，而不是仅仅取决于点突变在DNA链上的位

23、置(有人认为点突变在DNA链中部要比在近端部容易被SSCP检测出来)。White曾设计了一组样品DNA片段，并将其中的点突变设在DNA链的中部，而且该点又正处在发夹结构顶端的环上，结果发现SSCP只能检测出9个样品中的2个(检出率为22%)，说明DNA链中任何部位的突变，只要对其单链立体构象没有影响，都有可能被漏检。5.3.5 SSCP的结果断定:由于在SSCP分析中非变性PAG电泳不是根据单链DNA分子和带电量的大小来分离的，而是以单链DNA片段空间构象的立体位阻大小来实现分离的，因 此，这种分离不能反映出分子量的大小。有时正常链与突变链的迁移率很接近，很难看出两者之间的差别，因此一般要求电

24、泳长度在16-18cm以上，以检测限为指标来判定结果.检测限是指突变DNA片段与正常DNA片段可分辨的电泳距离差的最小值，大于检测限则判定链的迁移率有改变，说明该DNA序列有变化，小于检测限则说明链之间无变化。6 PCR-SSCP的发展现状9随着分子生物学技术的发展，检测基因结构和突变的方法不断涌现.尤其是PCR技术问世以后，各种与PCR相结合的基因检测技术进一步推动了基因研究的发展。如不对称 PCR产物的直接测序、核糖核酸酶酶切法(Ribonuclease cleavage，RNAase)、限制性片段长度多态性分析(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)等已成为基因分析的有力工具.但这些方法操作比较繁琐，局限性较大，或要求实验条件高，不适合一般临床实验室使用。1989年问世的PCR-SSCP(下文称SSCP)作为检测基因 突变的方法，经不断地改进和完善，更为简便、快速、灵敏，不但用于检测基因点突变和短序列的缺失和插入，而且还被用于DNA定量分析，监测PCR诊断实验中的交叉污染情况，