高效液相色谱法同时测定禽肉中的克伦特罗和沙丁胺醇(乙腈提取

1、高效液相色谱法同时测定禽肉中的克伦特罗和沙丁胺醇金雁姚家彪姜莉刘宁(沈阳出入境检验检疫局沈阳110016摘要建立高效液相色谱法同时测定禽肉中克伦特罗和沙丁胺醇两种2兴奋剂残留量的方法。用乙腈提取禽肉样品,过C18固相萃取柱净化,采用高效液相色谱分离,二极管阵列检测器检测,外标法定量。关键词高效液相色谱法克伦特罗沙丁胺醇禽肉残留分析引言克伦特罗(Clenbuterol,缩写C L和沙丁胺醇(Salbutam ol,缩写Sal是两种人工合成的2兴奋剂,具有降低胴体脂肪含量,提高瘦肉率的作用,曾一度被广泛用作生长促进剂1。在畜禽生产中滥用2兴奋剂将对人体健康造成极大损害,我国及欧美各国均已颁布法规禁

2、止2兴奋剂作为生长促进剂在畜牧生产上的应用24,但在经济利益的驱使下,违法滥用2兴奋剂现象仍较为普遍,中毒事件时有发生。2兴奋剂的检测方法主要有高效液相色谱法5、6 (HP LC、气质联用法7(G C2MS、液质联用法8(LC2 MS、免疫分析法9(I A、薄层色谱法10(T LC等。目前,关于2兴奋剂的单组分检测研究报道较多,多组分同时检测较少,因此,研究禽肉中克伦特罗和沙丁胺醇同时检测的方法具有重要意义。本文提出一种简单的提取、净化方法和新的流动相分离条件,采用外标法定量,建立快速灵敏的同时测定克伦特罗和沙丁胺醇的HP LC分析方法。1实验部分111仪器与试剂Agilent1100高效液相

3、色谱仪,配置四元泵、真空在线脱气机、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器(DAD、Agilent化学工作站(美国Agilent公司;色谱柱:Y MC2Pack ODS2A150mm416mm5m;Stra2 ta C182E固相萃取柱(美国Phenomenex公司。克伦特罗、沙丁胺醇(北京陆桥技术有限责任公司,含量均大于9910%;乙腈(色谱纯,甲醇(优级纯,超纯水(Millipore纯水机制备,其它试剂均为国产分析纯。112色谱条件流动相:乙腈水(pH310梯度洗脱595(0min2575(5min;流速:110m Lmin21;柱温:25;检测波长:196nm,210nm;进样量:10L。

4、113标准溶液的配制及标准曲线准确称取克伦特罗、沙丁胺醇标准品各10mg,用0101m olL21盐酸溶液溶解并定容至10m L。依次用超纯水稀释成浓度分别为0101gm L21、0104gm L21、011gm L21、012gm L21、014gm L21、1gm L21、4gm L21、10gm L21的克伦特罗、沙丁胺醇混合标准溶液,液相色谱测定,以各组分的色谱峰面积对浓度作线性回归得定量标准曲线。114样品的提取与净化称绞碎肉样10g,加入20m L乙腈,组织匀浆5min,4500rmin21离心10min,分出上清液,残渣中再加乙腈5m L,超声15min,4500rmin21离心

5、10min,合并上清液。上清液加10m L2正己烷分两次萃取,弃去正己烷层,上清液于40水浴中氮气吹至1m L,备用。分别用10m L甲醇、20m L蒸馏水先后淋洗C18柱,流速1m Lmin21。将上述提取液全部过C18柱,流速011m Lmin21富集,先用10%甲醇10m L淋洗柱,再用乙腈甲醇(19混合溶液洗脱,流速011m Lmin21,收集洗脱液6m L于离心管中,并于40水浴中氮气吹干,残渣用011m L0101m olL21盐酸溶解, 4000rmin21离心10min,上清液供液相色谱测定。2结果与讨论211色谱条件的选择21111检测波长的选择经二极管阵列检测器分别对克伦特

6、罗和沙丁胺醇进行紫外光谱测定,克伦特罗在210nm、243nm和296nm有3个峰值依次变低的吸收峰11,12,沙丁胺醇在196nm、225nm、275nm有3个峰值依次变低的吸收峰。考虑方法的灵敏度、光谱干扰等因素,选定克伦特罗的检测波长为210nm,43现代仪器(二五年第五期沙丁胺醇的检测波长为196nm 。21112流动相的选择分别选用甲醇水、乙腈水作流动相,对克伦特罗和沙丁胺醇进行试验,结果表明出峰时间、峰形、灵敏度、信噪比,乙腈优于甲醇。本实验采用梯度洗脱,乙腈水(pH310=595(0min 2575(5min 作为流动相。21113流动相pH 值的选择试验流动相pH 值为310、

7、410、510时,对样品保留及分离的影响。结果表明,随着pH 值的降低,克伦特罗和沙丁胺醇的保留时间缩短,有助于改善峰形,pH =310时效果最佳。本文确定流动相pH =310。212标准曲线以浓度对峰面积作图,得到克伦特罗、沙丁胺醇的标准曲线。克伦特罗、沙丁胺醇的线性范围为010110g m L 21,其线性方程和相关系数(见表1。表1克伦特罗、沙丁胺醇标准曲线方程及相关系数样品线性方程相关系数克伦特罗A =0116C +41810199983沙丁胺醇A =0117C +01740199992213固相萃取条件的优化由于禽肉中含有大量的脂类、蛋白质等干扰组分,样品经乙腈提取后若直接上样到固相

8、萃取柱,不但净化效果不理想,而且会造成柱子的堵塞。因此在上样前必须对提取液进行预处理,用正己烷萃取两次可以基本去除提取液中的脂类成分,有利于进一步的固相萃取净化。本实验采用C 18反相固相萃取柱,首先用10m L 甲醇活化柱,再用20m L 蒸馏水淋洗,将甲醇洗净。在实验中洗脱溶剂的强度、洗脱体积和速度都是影响净化效果和回收率的重要因素。分别用甲醇、含015%乙酸的甲醇溶液和乙腈甲醇(1 9混合溶液作洗脱溶剂,发现当使用乙腈甲醇(19混合溶液洗脱时,6m L 可将柱中待测组分有效洗脱出。洗脱速度会直接影响最终的洗脱效 率,速度太快会导致待测组分的流失,控制洗脱速为015、012、011、010

9、5m L min 21时进行比较,当速度控制在011m L min 21时,可得到较好结果。214样品的测定在本实验条件下,克伦特罗和沙丁胺醇标准品的色谱图(见图1,经提取、净化后的禽肉加标样品的色谱图(见图2。图1克伦特罗、沙丁胺醇标准品的高效液相色谱图11196nm 波长检测所得色谱图;21表示210nm 波长检测所得色谱图图2克伦特罗、沙丁胺醇加标禽肉样品的高效液相色谱图215样品回收率测定分别在禽肉中加入不同量的标准品,经过提取和固相萃取净化,应用高效液相色谱定量测定克伦特罗和沙丁胺醇在禽肉中的加标回收率(见表2。表2不同加标浓度克伦特罗和沙丁胺醇在禽肉样品中的回收率样品加标浓度(g

10、kg 21平均回收率(%测定次数相对标准偏差RS D (%克伦特罗沙丁胺醇3104011040611570128316681480169016555555813713511913513315表2中的加标浓度是指在每千克禽肉中加入药品的量,克伦特罗和沙丁胺醇在3个浓度的加标回收率均在6115%9016%之间,相对标准偏差均在10%以内。本方法禽肉中的克伦特罗检出限为3g kg 21,沙丁胺醇检出限为1g kg 21。3结论本文研究禽肉中克伦特罗和沙丁胺醇同时富集、分离、检测的条件,详细地考察各环节中的主要影响因素,建立起利用C 18固相萃取柱富集、净化,高效液相色谱仪同时分离、检测的方法,本方法

11、快速、准确、分离完全,具有良好的灵敏度和精密度。53二五年第五期研究报告参考文献1方炳虎,陈枚榴,黄显会1克伦特罗在猪体内生物利用度及药物动力学研究,畜牧兽医学报,1997,28(3:233237 2C ommission of the European C ommunities,O ff1J1Eur1C om2 mun,1985,L191:27313食品动物禁用的兽药及其它化合物清单1农业部2002193号公告4张中亚,徐海聂,瞿进文12兴奋剂的监测方法概述,肉品卫生,2000,187(1:8125苏文周,蔡玉枝,罗晓燕1高效液相色谱法测定猪尿中盐酸克伦特罗,中国卫生检验杂志,2001,11

12、(4:4364376康莉,仲岳桐,陈春晓等1固相萃取2高效液相色谱法测定肉中盐酸克伦特罗,中国卫生检验杂志,2003,13(1:53547吴平谷1生物材料中克伦特罗的气相色谱2质谱法测定,分析测试学报,2002,21(1:19218K aita De Wach,Hubert De Brabander and Dirk C ourtheyn1LC2 MS2MS to detect and identify four beta2ag onists and quantify clenbuterol in liver,Analyst,1998,123:270127059Sawaya W N,Lone

13、K,Husain A,et al1Screening for beta2ag2 onists in sheep urine and eyes by an enzyme2linked immunos or2 bent assay in the state of K uwait,F ood C ontrol,2000,11(1:1 510A1P osyniak,et al1Journal of Environmental S tudies,1996,5(5:333611NY43822001,饲料中盐酸克伦特罗(2兴奋剂的测定12中华人民共和国药典,北京:中国标准出版社,1995Simultaneo

14、us determination of clenbuterol and salbutamol inpoultry meat by HPLCJin Y anY ao JiabiaoJiang LiLiu Ning(Shenyang Enter2exit Inspection and Quarantine Bureau of the P1R1China Shenyang110016AbstractHigh performance liquid chromatographic method(HP LChave been developed for the simultaneous determi2

15、nation of clenbuterol and salbutam ol in poultry meat1The sam ples were extracted with acetonitrile and were cleaned up by C18s olid phase extraction(SPEcolumn1The analytes were separated by HP LC with diode array detector and quantified using external standard calibration curves1K ey w ordsHigh per

16、formance liquid chromatographyClenbuterolSalbutam olP oultry meatResidue analysis(上接第30页工艺相当复杂,其成品成分至今也无定论,但是利用红外光谱宏观指纹性,有可能揭示白酒的内在质量和品质。通过建立白酒标准红外指纹图谱,既可以完善白酒质量控制标准体系建设,使白酒生产规范化、科学化、又可以对假冒和伪劣白酒进行打击。参考文献1沈怡方主编1白酒生产技术全书,北京:中国轻工业出版社,19982郑玉芝,程江山,李晓等1液相色谱法分析白酒中糖精钠的含量,中国卫生检验杂志,2005,15(3:3103113刘剑平,孙慧,马继

17、勇1气相色谱法测得白酒中微量醛,中国卫生检验杂志,2005,15(3:3243254孙素琴,周群,梁曦云等1七种花旗参的FTIR光谱法无损鉴别,光谱学与光谱分析,2002,22(4:6005谢晶曦,常俊标,王绪明1红外光谱在有机化学和药物化学中的应用,北京:科学出版社,2001Discrimination of different alcohol by FTIR spectroscopyDeng Y uee1Sun Suqin2(1Department of Chemical Engineering,Henan Institute of Science and T echnology,X in

18、xiang453003(2Department of chemistry,Tsinghua University,Beijing100084AbstractJiannanchun alcohol,G uizhoumaotai alcohol(1#and fake G uizhoumaotai alohol(2#were analyzed by F ourier trans form in frared spectroscopy(FTIR.The findings indicated that the freeze-dry sam ples of alcohol with differ2 ent odor type had evident fingerprint characters in FTIR spectra and their second derivative spectra,while the freeze-fry products of true and