实验1-大肠杆菌的培养和分离

1、第一章第一章 微生物的利用微生物的利用实验实验1 大肠杆菌的培养和分离大肠杆菌的培养和分离什么是微生物？什么是微生物？乳酸杆菌乳酸杆菌黑曲霉黑曲霉微生物：微生物：结构简单、形体微小结构简单、形体微小的单细胞、多细胞或没有的单细胞、多细胞或没有细胞结构的细胞结构的低等生物低等生物。什么是培养基？什么是培养基？三角瓶三角瓶培养皿培养皿试管试管液体培养基：液体培养基：扩大培养，工业生产扩大培养，工业生产。固体培养基：固体培养基：分离纯化，鉴定菌种，计数，保藏。分离纯化，鉴定菌种，计数，保藏。凝固剂：琼脂凝固剂：琼脂培养基的配制培养基的配制营养成分营养成分功能和来源功能和来源碳源碳源氮源氮源生长因子生

2、长因子水水无机盐无机盐提供提供碳元素碳元素：主要是糖类：主要是糖类提供提供氮元素氮元素：蛋白胨、牛肉膏、尿素：蛋白胨、牛肉膏、尿素维生素、氨基酸和含氮碱基维生素、氨基酸和含氮碱基H2O，良好的溶剂良好的溶剂NaCl：维持一定的渗透压：维持一定的渗透压LB 培养基的配制培养基的配制LB固体培养基：固体培养基：蛋白胨蛋白胨 0.5g，酵母提取物酵母提取物 0.25g，氯化，氯化钠钠 0.5g，加水，加水50 mL，琼脂琼脂 1g。调节调节pH 至至7.6。封口膜封口膜菌落：单细菌的克隆菌落：单细菌的克隆菌落：菌落：在在固体培养基固体培养基上，由上，由单个细菌单个细菌繁殖而来的一个繁殖而来的一个肉眼

3、可见的具有特定形状的肉眼可见的具有特定形状的子细胞群体子细胞群体。霉菌霉菌大肠杆菌大肠杆菌菌落的作用：菌落的作用：鉴定菌种的重要依据鉴定菌种的重要依据菌落特征：菌落特征：菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等。菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等。大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌：大肠杆菌：革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌。革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌。怎样无菌操作？怎样无菌操作？高压蒸汽灭菌：高压蒸汽灭菌：培养皿培养皿、试管、试管、三角瓶三角瓶、枪头、枪头、玻璃三玻璃三角刮刀角刮刀、接种环接种环、镊子。、镊子。在在121下灭菌下灭菌15 min。高压蒸汽灭菌锅高压蒸汽灭菌锅培养皿培养皿三角瓶三角瓶玻璃三角

4、刮刀玻璃三角刮刀接种环接种环微量移液器微量移液器枪头枪头棉花塞、封口膜、牛皮纸或旧报纸、橡皮筋棉花塞、封口膜、牛皮纸或旧报纸、橡皮筋不能用脱脂棉：易吸水，容易引起污染。不能用脱脂棉：易吸水，容易引起污染。酒精灯和酒精棉球酒精灯和酒精棉球灭菌：灭菌：杀死所有微生物。杀死所有微生物。消毒：消毒：杀死部分微生物杀死部分微生物（不包括芽孢和孢子不包括芽孢和孢子）。）。超净工作台超净工作台打开紫外灯和过滤风，灭菌打开紫外灯和过滤风，灭菌30 min。点燃酒精灯点燃酒精灯酒精棉擦拭桌面酒精棉擦拭桌面酒精棉球擦手。酒精棉球擦手。酒精灯火焰附近旁进行酒精灯火焰附近旁进行灼烧灭菌灼烧灭菌防止杂菌污染防止杂菌污染

5、用细菌过滤器除菌：用细菌过滤器除菌：尿素加热会分解，用尿素加热会分解，用G6玻璃砂玻璃砂漏斗漏斗过滤。过滤。什么是倒平板？什么是倒平板？将灭菌后的固体培养基倒入已灭菌的培养皿中，冷却凝固后将灭菌后的固体培养基倒入已灭菌的培养皿中，冷却凝固后制成的培养基。制成的培养基。Step1：培养基的配制和灭菌：培养基的配制和灭菌将将50 mL LB液体培养基液体培养基、50 mL LB固体培养基固体培养基和培养和培养皿进行皿进行高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌。无菌水无菌水培养皿用牛皮纸包扎培养皿用牛皮纸包扎Step2：倒平板：倒平板在酒精灯火焰旁在酒精灯火焰旁将三角瓶中的将三角瓶中的固体培养基（冷却到固体培养基

6、（冷却到60）倒入灭菌的培养皿中，置于水平放置上，并倒入灭菌的培养皿中，置于水平放置上，并轻轻晃动轻轻晃动，待，待凝固凝固后形成平面。后形成平面。超净台超净台Step3：接种后扩大培养：接种后扩大培养将将斜面斜面上培养的大肠杆菌菌种上培养的大肠杆菌菌种接种接种到到灭菌后的液灭菌后的液体培养基体培养基中，使其在中，使其在37摇床培养摇床培养12 h 。恒温摇床恒温摇床Step4：平板划线分离：平板划线分离用用接种环接种环在培养大肠杆菌的三角瓶中在培养大肠杆菌的三角瓶中蘸取菌液一次蘸取菌液一次，在，在固体培养基的固体培养基的平板上连续划线平板上连续划线。将。将培养皿倒置培养皿倒置，放在，放在37

7、恒温箱中恒温箱中培养培养1224 h。怎样在平板上划线？怎样在平板上划线？1次次2次次3次次4次次连续划线法连续划线法分区划线法分区划线法原因：原因：随着随着划线次数的增加划线次数的增加，菌数越来越少菌数越来越少，最终在划，最终在划线的末端出现由一个细菌繁殖而来的线的末端出现由一个细菌繁殖而来的单个菌落单个菌落。为什么通过划线分离可得到单菌落？为什么通过划线分离可得到单菌落？原因：原因：既可以使培养基表面的既可以使培养基表面的水分更好地挥发水分更好地挥发，又可以防，又可以防止止皿盖上的水珠落入培养基皿盖上的水珠落入培养基中造成污染。中造成污染。恒温培养时培养皿倒置恒温培养时培养皿倒置培养皿倒置

8、培养皿倒置皿盖皿盖皿底皿底恒温培养箱恒温培养箱Step5：菌种的斜面保存：菌种的斜面保存将接种环将将接种环将单菌落单菌落取出，用划线法接种在取出，用划线法接种在斜面培养斜面培养基基上，上，37培养培养24 h后，置于后，置于4冰箱冰箱中保存。中保存。斜面培养基斜面培养基试管斜面培养基的制作试管斜面培养基的制作方法：方法：将未凝固的含有琼脂的培养基加入试管中，灭菌将未凝固的含有琼脂的培养基加入试管中，灭菌后将后将试管斜放，令其冷却试管斜放，令其冷却，固体培养基即成为，固体培养基即成为斜面斜面。平板划线分离法平板划线分离法灼烧接种环灼烧接种环外焰外焰先灼烧后冷却：先灼烧后冷却：以免接种环温度太高，

9、杀死菌种。以免接种环温度太高，杀死菌种。接种环冷却后，蘸取带菌培养物接种环冷却后，蘸取带菌培养物在近火焰处，让带菌接种环在固体培养在近火焰处，让带菌接种环在固体培养 基上划线基上划线恒温培养箱中倒置培养恒温培养箱中倒置培养分区划线法分区划线法每次划线之前都要灼烧接种环。每次划线之前都要灼烧接种环。总是从上一次划线的末端开始划线。总是从上一次划线的末端开始划线。稀释涂布分离法稀释涂布分离法用用无菌吸管无菌吸管吸取吸取1mL细菌培养液细菌培养液加入另一个盛有加入另一个盛有9mL无菌水无菌水的试管中，混合均匀，以此制成的试管中，混合均匀，以此制成10-1倍倍的稀释液。的稀释液。梯度稀释菌液：梯度稀释

10、菌液：10-510-7倍倍滴加菌液滴加菌液用用无菌吸管无菌吸管取取0.1mL稀释度不同的菌液，加在培养皿稀释度不同的菌液，加在培养皿的固体培养基上。的固体培养基上。用玻璃刮刀涂布用玻璃刮刀涂布玻璃涂棒玻璃涂棒将将玻璃刮刀玻璃刮刀放在酒精灯火焰上灼烧，待玻璃刮刀冷却后，在酒放在酒精灯火焰上灼烧，待玻璃刮刀冷却后，在酒精灯旁打开培养皿，将精灯旁打开培养皿，将菌液涂布菌液涂布到整个培养基表面。到整个培养基表面。将培养皿倒置，在将培养皿倒置，在37恒温箱中培养恒温箱中培养2448 h。 恒温培养箱中培养恒温培养箱中培养恒温培养箱恒温培养箱结果：结果：以每个培养皿中有以每个培养皿中有20个以内的个以内的

11、单菌落单菌落最为合适。最为合适。10-110-210-310-410-5倒平板倒平板平板划线分离平板划线分离练一练，识一识练一练，识一识稀释涂布分离稀释涂布分离接种环接种环玻璃刮刀玻璃刮刀例题：例题：要获得遗传特性单一的要获得遗传特性单一的大肠杆菌菌种大肠杆菌菌种，一般必须对，一般必须对原有的大肠杆菌菌种进行原有的大肠杆菌菌种进行扩大培养扩大培养，并利用，并利用纯化技术纯化技术得到得到单菌落的菌种单菌落的菌种。请回答下列有关大肠杆菌的培养和分离实。请回答下列有关大肠杆菌的培养和分离实验的相关问题：验的相关问题：（1）对买回来的大肠杆菌菌种进行）对买回来的大肠杆菌菌种进行扩大培养扩大培养，一般用

12、，一般用LB培培养基，在培养基中为微生物提供养基，在培养基中为微生物提供碳源、氮源和能源碳源、氮源和能源的物质的物质主要是主要是，为，为调节渗透压调节渗透压，要加入一，要加入一定量的定量的。为进行大肠杆菌的。为进行大肠杆菌的分离分离，还要加入，还要加入 配配制成固体培养基，并进行制成固体培养基，并进行倒平板倒平板的操作。的操作。蛋白胨和酵母提取物蛋白胨和酵母提取物氯化钠氯化钠琼脂琼脂（2）获得）获得纯净微生物培养物纯净微生物培养物的关键是的关键是，为，为此，必须对培养此，必须对培养器皿、接种用具器皿、接种用具和培养基进行严格灭菌。培和培养基进行严格灭菌。培养器皿和培养基一般采用养器皿和培养基一般采用 法灭菌，接种环采用法灭菌，接种环采用灼烧法灭菌灼烧法灭菌。同时在。同时在接种或倒平板接种或倒平板操作时，除了在超净台上操作时，除了在超净台上进行操作并对实验者的衣着、手和实验空间进行严格清洁和进行操作并对实验者的衣着、手和实验空间进行严格清洁和消毒外，还必须消毒外，还必须 以防止空气中的杂以防止空气中的杂菌污染。菌污染。（3）大肠杆菌菌种的）大肠杆菌菌种的扩大培养扩大培养一般采用液体培养基，接种一般采用液体培养基，接种后将培养基置于后将培养基置于37摇床振荡摇床振荡条件下培养条件下培养12 h。菌种的。菌种的分离分离一般在固体培养基上采用一般在固体培养基上采用法，并将培养皿以法，