临床聚合酶链反应试剂盒的选用和质检

1、临床聚合酶链反应试剂盒的选用和质检 PCRPCR技术自技术自19891989年开始被应用于临床检验年开始被应用于临床检验以来，以其快速、简便、灵敏等优点很快地以来，以其快速、简便、灵敏等优点很快地成为临床实验诊断学的一个技术热点成为临床实验诊断学的一个技术热点. .目前，目前，临床临床PCRPCR检验已经广泛使用商品化、规范化的检验已经广泛使用商品化、规范化的试剂盒试剂盒 PCRPCR试剂盒的质量对测定结果的影响是直接而试剂盒的质量对测定结果的影响是直接而 且是至关重要的且是至关重要的 试剂盒的质量不但受到生产过程中质量控制试剂盒的质量不但受到生产过程中质量控制 诸要素的影响，原材料的质量、方

2、法学设计、包诸要素的影响，原材料的质量、方法学设计、包 装、运输和贮存等一系列的环节，都对试剂盒的装、运输和贮存等一系列的环节，都对试剂盒的 质量有决定性的影响质量有决定性的影响 如何选择质量好的且符合自己实验室要的如何选择质量好的且符合自己实验室要的试剂盒？试剂盒？ 如何保证拿到手里的试剂盒具有好的质量如何保证拿到手里的试剂盒具有好的质量? ? PCRPCR或或RT-PCRRT-PCR试剂盒的组成试剂盒的组成 核酸提取试剂核酸提取试剂 核酸扩增或反转录核酸扩增试剂核酸扩增或反转录核酸扩增试剂 产物检测试剂产物检测试剂 影响影响PCR试剂盒质量的因素试剂盒质量的因素 标本处理（核酸提取）方法、

3、用于核酸扩标本处理（核酸提取）方法、用于核酸扩 增的原材料及方法学设计增的原材料及方法学设计 运输和贮存中所存在的问题运输和贮存中所存在的问题 核酸提取方法核酸提取方法 经典方法：酚氯仿抽提法，提取效率高、纯度经典方法：酚氯仿抽提法，提取效率高、纯度好，但过程繁琐，易增加标本间相互污染的机会好，但过程繁琐，易增加标本间相互污染的机会 简便方法：煮沸裂解法、玻璃粉或硅吸附法等简便方法：煮沸裂解法、玻璃粉或硅吸附法等 核酸提取除了要求操作简便外，更重要的是提取的核酸提取除了要求操作简便外，更重要的是提取的效率及纯度，因此煮沸裂解法已被核酸纯化方法替效率及纯度，因此煮沸裂解法已被核酸纯化方法替代。代

4、。 核酸提取的效率及纯度的检测核酸提取的效率及纯度的检测 使用已知阳性（包括病毒含量）的溶血和脂使用已知阳性（包括病毒含量）的溶血和脂血血清标本，用试剂盒提供的标本处理方法提取血血清标本，用试剂盒提供的标本处理方法提取核酸后扩增检测，与无溶血和脂血的血清标本比核酸后扩增检测，与无溶血和脂血的血清标本比较，观察测定结果的差异，从而判断提取方法的较，观察测定结果的差异，从而判断提取方法的优劣。优劣。 核酸扩增所需的原材料核酸扩增所需的原材料 寡核苷酸引物寡核苷酸引物 扩增缓冲液扩增缓冲液 dNTP Taq酶以及反转录酶等酶以及反转录酶等 寡核苷酸引物和探针寡核苷酸引物和探针 引物和探针纯度对试剂盒

5、的质量的影响引物和探针纯度对试剂盒的质量的影响 纯度纯度的高低可根据的高低可根据260/280260/280吸光度比值来判断，如小于，吸光度比值来判断，如小于，则需重新纯化则需重新纯化 引物和探针的结合特异性引物和探针的结合特异性 应减少假阳性或假阴应减少假阳性或假阴性的出现性的出现 扩增缓冲液和扩增缓冲液和dNTP 缓冲液包括：缓冲液包括：Tris-HCL(pH8.38.8)，KCl或或NaCl ，酶保护剂如小牛血清蛋白、明胶、，酶保护剂如小牛血清蛋白、明胶、Tween20或或DTT Mg2+ ，过高或过低镁离子浓度均不利于扩增，过高或过低镁离子浓度均不利于扩增 四种四种dNTP的终浓度应相

6、等的终浓度应相等 TaqTaq酶以及反转录酶酶以及反转录酶 酶浓度太高，则会出现非特异扩增；过低时，酶浓度太高，则会出现非特异扩增；过低时，则靶序列产量很低则靶序列产量很低 。 每每100l100l反应液中含反应液中含1 1（比活性为（比活性为20U/pmol20U/pmol）Taq DNATaq DNA聚合酶为佳聚合酶为佳 产产 物物 检检 测测 杂交固相：通常为聚丙烯微孔板和硝酸纤维素膜，杂交固相：通常为聚丙烯微孔板和硝酸纤维素膜，其质量高低直接影响产物的测定其质量高低直接影响产物的测定 标记物：最常用的是辣根过氧化物酶（标记物：最常用的是辣根过氧化物酶（HRPHRP） 试剂盒的运输和贮存

7、试剂盒的运输和贮存贮存：核酸扩增部分贮存：核酸扩增部分2020，产物检测部分试剂，产物检测部分试剂则应贮存于则应贮存于2 288 有效期有效期: :在适当的贮存温度下，在适当的贮存温度下，PCRPCR试剂盒的一般试剂盒的一般为为6 6个月个月 临床临床PCRPCR试剂盒的分类试剂盒的分类 临床临床PCRPCR试剂盒按其测定目的可分为定性和定量试剂盒按其测定目的可分为定性和定量测定两大类测定两大类 前者主要是用于未知病因患者的临床病因诊断前者主要是用于未知病因患者的临床病因诊断 后者则是用于已知患者治疗的动态观察后者则是用于已知患者治疗的动态观察 目前国内用于定性测定的目前国内用于定性测定的PC

8、RPCR试剂盒的测定模试剂盒的测定模式主要有式主要有PCRPCRELISAELISA和和PCRPCR膜上杂交（杂交流）膜上杂交（杂交流）和分子信标荧光检测等；用于定量测定的试剂盒的和分子信标荧光检测等；用于定量测定的试剂盒的测定模式则主要有测定模式则主要有TaqManTaqMan和和AmplisensorAmplisensor荧光定量荧光定量以及以及PCRPCRElisaElisa定量等定量等 临床临床PCR试剂盒的选用原则试剂盒的选用原则 参考实际生产厂家的信息广告参考实际生产厂家的信息广告 参考同行对有关试剂盒的使用效果参考同行对有关试剂盒的使用效果 参考有关机构的综合评价参考有关机构的综

9、合评价 如何选择适用的试剂盒如何选择适用的试剂盒 根据使用目的的选择根据使用目的的选择 根据所在实验室的技术特点选择根据所在实验室的技术特点选择 根据所在地区患者的承受能力选择根据所在地区患者的承受能力选择 临床临床PCR试剂盒的质检试剂盒的质检 内外包装的检查（厂家名称、检测目的、批准文内外包装的检查（厂家名称、检测目的、批准文号、批号和有效期等号、批号和有效期等) )，内包装的检查主要是看试剂，内包装的检查主要是看试剂瓶是否漏液、真空包装是否破损、试剂是否齐全以瓶是否漏液、真空包装是否破损、试剂是否齐全以及是否有使用说明书等及是否有使用说明书等 试剂盒测定性能的检验（采用试剂盒测定性能的检验（采用“血清盘血清盘”进行进行 ）血清盘是由一定数量的原血清阴阳性样本、以血清盘是由一定数量的原血清阴阳性样本、以及及3-53-5份系列稀释阳性样本所组成份系列稀释阳性样本所组成 原血清样本可用于判断原血清样本可用于判断PCRPCR试剂盒对特定病原试剂盒对特定病原体核酸检出的特异性、灵敏度和符合率；系列体核酸检出的特异性、灵敏度和符合率；系列稀释阳性样本用于判断试剂的测定下限稀释阳性样本用于判断试剂的测定下限 质检时，用待检质检时，用待检PCRPCR试剂盒测定血清盘中的各试剂盒测定血清盘中的各份样本，以血清盘的结