伤寒副伤寒甲乙三联菌苗制造及检定规程

1、伤寒副伤寒甲乙三联菌苗制造及检定规程本品系用伤寒、副伤寒甲、乙菌分别培育，取菌苔制成悬液 经甲醛杀菌，以磷酸盐缓冲生理盐水稀释成每ml含伤寒菌1.5亿、副伤寒甲、乙菌各0.75亿制成。用于预防伤寒及副伤寒甲、 乙。1菌种1.1菌种来源制造伤寒、副伤寒甲、乙三联菌苗用的菌种及检定菌种用的 各种诊断血清，应由中国药品生物制品检定所分发或经同意。1.2 菌种检定检定菌种可用pH7.27.4的肉汤琼脂、马丁琼脂或其他适 宜的培养基。1.2.1 培养特性各菌株应具有典型的形态、培养及生化特性。1.2.2 血清凝集试验用37C培育1820小时的培养物以磷酸盐缓冲生理盐水稀 释成含菌6亿/ml，与相应的伤寒

2、、副伤寒甲、乙菌诊断血清做 定量凝集试验，摇匀后放 37C过夜，以肉眼可见到凝集（+）之 血清最高稀释度为凝集反应之效价，凝集价不应低于血清原效价 之半。伤寒菌种加用伤寒 Vi及0血清做凝集试验，应与Vi血清 有凝集，与0血清不凝集，或仅有较低凝集。123 毒力试验用37C培育1216小时的琼脂培养物以生理盐水稀释为下列浓度的菌液：伤寒、副伤寒乙菌种：3亿/ml、1.5亿/ml及0.75/ml。副伤寒甲菌种；15亿/ml、7.5亿/ml及3.75亿/ml。根据菌种毒力情况稀释度可作更改，也可增加稀释度。每一稀释度的菌悬液腹腔注射体重1416g之小白鼠，至少5只，每只0.5ml，观察3天，使小白

3、鼠于感染后 3天内全部死 亡的最小剂量为1个致死量（LD）,伤寒、副伤寒乙菌种1LD应 不超过1.5亿菌，副伤寒甲不超过 7.5亿菌。1.2.4 毒性试验用37 C培育1820小时之琼脂培养物混悬于磷酸盐缓冲生 理盐水内，伤寒及副伤寒甲菌液加温 56C1小时，副伤寒乙菌液 加温58C1小时杀菌（或其他方法杀菌），不加防腐剂。杀菌试 验合格后稀释为每 ml含菌60、30及15亿等3个浓度，每一浓 度的菌悬液以0.5ml腹腔注射体重1518g小白鼠5只，观察3 天，注射7.5亿菌之小白鼠应全部生存，注射 15亿菌之5只小 白鼠可有3只死亡。1.2.5 免疫力试验用加温杀菌（或用其他方法杀菌）不加防

4、腐剂的菌液稀释成 如下的浓度：伤寒及副伤寒乙菌液：2.5亿/ml。副伤寒甲菌液：5亿/ml。每一菌液免疫体重1416g小白鼠至少30只，每只皮下注 射上述浓度的菌液0.5ml。注射2次，间隔7天，末次免疫后9 11天进行毒菌攻击。每种死菌菌液免疫之小白鼠各腹腔注射1LD的相应毒菌（含于0.5ml中），同时应用同批饲养或体重与免疫 组相同的小白鼠3组，每组至少5只作对照，分别于腹腔注射2、 1及1/2LD的毒菌（各含于0.5ml中），观察3天。对照组小白 鼠感染2及1LD者应全部死亡，感染1/2LD者要有部分死亡。伤 寒、副伤寒乙菌液免疫组至少保护70%、白鼠活存，副伤寒甲菌液免疫组至少保护60

5、%、白鼠活存，则免疫力试验为合格。免疫力试验也可用LD50法判定结果:用加温杀菌（或用其他方法杀菌）不加防腐剂的菌液稀释成 如下的浓度：伤寒及副伤寒乙菌液：2.5亿/ml。副伤寒甲菌液：5亿/ml。每一菌液免疫体重1416g之小白鼠至少30只，每只皮下 注射上述浓度的菌液0.5ml，注射2次，间隔7天，末次免疫后 911天，用培养1216小时的伤寒、副伤寒甲或乙菌株之菌 苔以pH7.27.4的肉汤及生理盐水等稀释至适当的浓度进行攻 击。免疫组小白鼠应感染100个LB。以上的毒菌。同时应用同批 饲养或体重与免疫组相同的小白鼠分为34组，每组至少5只，分别感染不同剂量毒菌作对照。免疫组及地照组分别

6、腹腔注射 0.5ml，观察3天，计算LD50。免疫组至少应保护 70%、白鼠存 活。在做免疫力试验时，应以参考菌苗作对照。1.2.6 抗原性试验选体重2kg左右之健康家兔至少3只，用免疫力试验所用之 菌液静脉注射3次每次0.5ml，第1次注射7亿菌，第2次14 亿菌，第3次21亿菌，每次间隔7天。末次注射后1014天采 血做定量凝集试验测定效价。 伤寒菌免疫的血清对免疫菌效价应不低于1 : 12800,副伤寒甲、乙效价不低于 1 : 6400, 2/3家兔 血清之凝集价达上述要求即为合格。1.3 菌种保存菌种应冻干保存，冻干菌种保存于28C。菌种冻干后应抽取样品按 1.2项进行检查，合格后可使

7、用 3 年。以后每次生产前必须检查全部特性一次，合格者可继续使用2年。2菌苗制造制造伤寒、副伤寒甲、乙三联菌苗所用的每一菌种选用2个菌株。2.1 菌种冻干菌种启开后应检查菌形、纯度及进行玻片凝集试验 （伤寒菌加用Vi血清），合格后即可使用。每启开1支冻干菌种用于生产不应超过6代。2.2 制造用培养基用pH7.27.4的马丁琼脂或肉汤琼脂或其他适宜的培养2.3 原液制造2.3.1 接种采用涂种，接种后置 37C培育1814小时。232 采集采集前逐瓶检查，有杂菌者废弃。刮取菌苔混悬于磷酸盐缓 冲生理盐水中。2.3.3 纯菌试验原液采集后应逐瓶取样接种琼脂斜面1管，于37 C培育3天，2426C1

8、天，有杂菌生长应废弃。2.3.4 杀菌原液用甲醛溶液杀菌，各种原液加入甲醛溶液浓度如下：伤寒菌原液不超过1.1%土 0.1% ( ml /ml )。副伤寒甲菌原液不超过 1.4%± 0.1% ( ml /ml )。副伤寒乙菌原液不超过 1.8%± 0.2% ( ml /ml )。加杀菌剂后的原液应放在 37C，不得超过7天，以后保存 于28°C。无菌试验纯菌试验合格的原液，应取样接种不含琼脂的硫乙醇酸盐培 养基及普通琼脂斜面各1管，放37 C培育5天有本菌生长，可 加倍量复试一次；有杂菌生长应废弃。236原液合并无菌试验合格之原液，按不同菌株或不同制造日期分别过滤

9、 合并，合并后应加不超过 0.5% (g /ml )的苯酚或其他适宜之 防腐剂，保存于28C。2.4 原液检定2.4.1 镜检菌形应正常，无杂菌。2.4.2 凝集试验原液与相应血清进行凝集试验，其凝集效价不应低于血清原 效价之半。无菌试验按生物制品无菌试验规程进行。2.4.4 浓度测定应按中国细菌浊度标准与质量检定部门会同测定浓度245免疫力试验原液于无菌试验合格后与质量检定部门会同进行。抽验批数应不少于生产批数的1/5。方法同项，唯所用小白鼠每组 至少15只。对伤寒或副伤寒甲乙毒菌之攻击，均应保护60%、白鼠活存为合格。2.5 原液保存原液应保存于28C。原液自采集之日起至用于菌苗稀释 时不

10、得少于4个月，保存效期自采集之日起为2年半。2.6 菌苗稀释2.6.1 原液配合稀释前应先将不同菌种所制之原液按比例配合。每一种菌所加的菌数与应加菌数在总菌数不变的原则下，允许两种菌之间在20%勺范围内互有增减；同一种菌不同菌株之原液按等量混合， 但每个菌株所加的菌数与应加菌数在总菌数不变的原则下，允许两个菌株之间在40%范围内互有增减。2.6.2 菌苗稀释稀释菌苗用含0.25%0.5% (g /ml )苯酚或其他适宜的防 腐剂之磷酸盐缓冲生理盐水。263 苗菌浓度菌苗每ml含伤寒菌1.5亿，副伤寒甲及副伤寒乙菌各 0.75 亿。2.7 菌苗分批同组配合的原液用同批稀释液在同一日稀释的种瓶菌苗

11、为1批。大罐稀释时应按大罐分批，并按分装机分为亚批。2.8 检定稀释后每批应逐瓶抽样进行无菌试验及测定防腐剂含量(大罐稀释时除外)。2.9 分装分装后应每亚批抽样送质量检定部门进行成品检定。3成品检定3.1物理化学检查菌苗应为乳白色悬液，pH值为6.87.4，不应有摇不散的 菌块或异物。苯酚含量应为 0.25%0.5% (g /ml )。3.2 菌形及纯度染色镜检，应为革兰氏阴性杆菌。至少观察10个视野，平均每个视野内不得有10个以上非典型菌（线状、粗大或染色可 疑杆菌），并不应有杂菌。3.3 无菌试验按生物制品无菌试验规程进行。3.4 安全试验341 毒性试验用体重1820g之健康小白鼠5只，每只腹腔注射菌苗0.5ml，或用体重350450g之健康豚鼠2只，腹腔注射菌苗 1.