叶酸受体介导卵巢癌细胞靶向白蛋白纳米粒的体外研究

1、_叶酸受体介导卵巢癌细胞靶向白蛋白纳米粒的体外研究*张良珂1侯世祥1毛声俊1魏大鹏2宋相容1乔小蓉31. 四川大学华西药学院药剂教研室 （成都610041）；2. 四川大学基础医学与法医学院免疫教研室；3. 四川大学分析测试中心【摘要】 目的 研究能通过叶酸受体介导靶向肿瘤细胞的叶酸偶联白蛋白纳米粒。方法 利用叶酸活性酯在碱性条件下与白蛋白纳米粒表面上的氨基反应，制得叶酸偶联的白蛋白纳米粒。以荧光定量法确定浓度、时间、游离叶酸对肿瘤细胞摄取叶酸偶联白蛋白纳米粒的影响程度。结果 成功制备了叶酸偶联白蛋白纳米粒。叶酸偶联白蛋白纳米粒的肿瘤细胞摄取量随纳米粒浓度增大、培养时间延长而增加，肿瘤细胞对叶

2、酸偶联白蛋白纳米粒的摄取可被过量的外源性游离叶酸所抑制。结论 叶酸偶联白蛋白纳米粒能通过细胞膜上的叶酸受体介导内吞入胞，可显著靶向于叶酸受体丰富的肿瘤细胞。【关键词】 白蛋白纳米粒 叶酸受体 靶向Study on the ovarian tumor cell targetability of folate receptor-mediated albumin nanoparticles【Abstract】Objective To study folate-conjugated albumin nanoparticles targeting to tumor cells via folate re

3、ceptor-mediated endocytosis. Methods The activated folic acid (N-hydroxysuccinimide ester of folic acid) were conjuated to the surface of BSANP via the amino groups. The extent that concentration, incubated time and free folate influenced uptake of folate-BSANPs by SKOV3 cell was determined respecti

4、vely using fluorescence spectrophotometer. Results Folate-conjugated BSANP (Folate-BSANP) was successfully achieved. Uptake of folate-BSANPs by tumor cells was gradually increased while extending incubated time or increasing concentration of folate-BSANPs and could be competitively inhibited by exce

5、ss free folate. Conclusion Folate-BSANP could be delivered into tumor cells via folate receptor-mediated endocytosis and significantly targeted to tumor cells with rich folate receptors.【Key words】Albumin nanoparticles ; Folate receptor ; Targeting随着对细胞膜表面叶酸受体认识的逐步深入研究发现，在多种肿瘤细胞(如卵巢癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌和肾细胞

6、癌等)膜表面上的叶酸受体活性和数量显著高于一般正常细胞，为叶酸受体介导药物靶向于肿瘤细胞的研究奠定了基础1。白蛋白分子中赖进行了研究，并选用人卵巢癌SKOV3细胞作为模型细胞，考察folate-BSANP 对肿瘤细胞的靶向效果。 1 材料和方法 1.1 材料 Startorious 1721型电子天平（德国）、UV-2201型紫外可见分光光度计（日本Shimadzu公司）、Malvern-2000型激光散射粒径分析仪（英国）、85-2型恒温磁力搅拌器（上海司乐仪器厂）、HITACHIH-600 透射电子显微镜（日本）、SHZ-88-1型台式水浴恒温振荡器（江苏太仓鹿河生化仪器厂）、RF-500

7、0荧光分光光度计（日本）、Olympus荧光显微镜（日本）、SHEL-LABl815Tc型CO2恒温培养箱。 氨酸数目众多（约占残基数的10%）。暴露于白蛋白纳米粒表面的赖氨酸-氨基及末端氨基，即表面活性氨基（surface reactive amino groups, SRAG），系其进行化学修饰的有效连接部位。为此我们首次制备了叶酸偶联白蛋白纳米粒（folate conjugated bovine serum albumin nanoparticles，folate-BSANP），对其相关性质* 高等学校博士学科点专项科研基金 (20020610092)通讯作者，Tel：86-28-855

8、02809，Fax：86-28-85502809，E-mail：housix 牛血清白蛋白（生化试剂，上海伯奥生物科技有限公司）、Sephadex G-50（Pharmacia）、N-羟基琥珀酰亚胺（Sigma）、叶酸（Sigma）、二环己基碳二亚胺_中国科技论文在线（Acros）、胰蛋白酶（生化试剂，上海伯奥生物科技有限公司）、异硫氰酸荧光素（Sigma）、SKOV3细胞（本校免疫教研室提供）、无叶酸细胞培养液（Gibco），其余药品、试剂均为分析纯。2 方法1.2.1 白蛋白纳米粒 (BSANP) 的制备 取牛血清白蛋白（BSA）适量，精密称重后加蒸馏水溶解，室温搅拌下缓慢滴加适量的无水乙

9、醇。续缓加入适量戊二醛溶液，搅拌12h，减压蒸馏除去乙醇，即得BSANP的胶体混悬液。1.2.2 叶酸活性酯的制备 500mg的叶酸溶于10ml二甲亚砜（已预先加入0.25ml的三乙胺），搅拌下加入适量的二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，室温反应过夜。过滤，除去反应中生成的副产物二环己基脲，减压浓缩至干。用乙醚洗涤残余固体，得浅黄色固体粉末，即叶酸活性酯2。1.2.3 Folate-BSANP的制备 取BSA-NP胶体混悬液适量，用NaCO3/NaHCO3缓冲溶液（pH=11.5）调pH为9，加入适量的叶酸活性酯的二甲亚砜溶液，室温搅拌。用Sephadex G-50葡聚糖凝胶柱进行分离，收

10、集先流出的有乳光部分，即Folate-BSANP胶体混悬液。1.2.4 Folate-BSANP偶联程度的测定 测定Folate-BSANP胰蛋白酶水解液在358nm处的吸光度，在相应的标准曲线上可得单位质量BSA上偶联叶酸的量，并采用2,4,6-三硝基苯磺酸显色法3测定了BSANP的表面活性氨基的含量。1.2.5 Folate-BSANP的形态观察 分别将所得Folate-BSANP溶液上样G-50 Sephadex柱，蒸馏水进行洗脱，收集乳光部分。室温条件下用2%磷钨酸负染样品后，HITACHI H-600 透射电子显微镜观察粒子形态，并拍摄照片。1.2.6 BSA-NP与Folate-B

11、SANP的粒径大小分布测定 室温条件下，分别取BSA-NP与Folate-BSANP胶体混悬液适量，加入至蒸馏水400ml中，用激光散射粒径分析仪分别测定所得纳米粒的粒径及其分布。1.2.7 Folate-BSANP与BSANP的肿瘤细胞摄取实验 采用人卵巢癌细胞(SKOV3)作为模型细胞，用异硫氰荧光素(FITC)对BSA分子进行荧光标记，以荧光定量的方法考察skvo3细胞摄取纳米粒的情况。 将SKOV3细胞接种到24孔板上，每孔约3×104个细胞，孵育约24h后，换液，用PBS洗涤，换10%小牛血清/无叶酸RPMI1640配制的培养液对人卵巢癌细胞（SKOV3）贴壁培养(37，5

12、%CO2培养箱)24。所得样本用于下述实验。 1.2.7.1 纳米粒浓度对肿瘤细胞摄取的影响 分别加1.0ml上述培养液配制的各浓度Folate-BSANP或BSANP胶体溶液于含预培养SKOV3细胞的孔内，培养4。 1.2.7.2 培育时间对肿瘤细胞摄取Folate-BSANP与BSANP的影响 分别取0.45mg/ml的Folate-BSANP或BSANP胶体溶液1.0ml于含预培养SKOV3细胞的孔内，培养0、0.5、1、2、3和4。 1.2.7.3 游离叶酸对肿瘤细胞摄取的影响 分别加上述培养液配制的含不同浓度叶酸的0.45mg/ml Folate-BSANP或BSANP胶体溶液1.0

13、ml于含预培养SKOV3细胞的孔内，培养4。 上述方法培养后的SKOV3细胞均用冷磷酸缓冲液洗涤(1.0ml×6)，1%TritonX 100PBS缓冲液(0.75ml)破细胞，用荧光分光光度计测定细胞溶解液荧光（ex=490nm，em=520nm）。 1.2.7.4 Folate-BSANP与BSANP肿瘤细胞摄取的定性观察 将SKOV3细胞贴壁预培养于玻片上,分别加入相同浓度的Folate-BSANP和BSANP培养3，磷酸缓冲液洗涤，SKOV3细胞固定，荧光显微镜观察并摄片记录。 2 结果 2.1 Folate-BSANP与BSANP的形态、粒径大小及分布 透射电镜观察，纳米粒

14、形态圆整，大小较均匀，见图1。激光散射法测定的BSANP平均粒径为64nm，90%的粒径小于119nm。Folate-BSANP平均粒径为66nm，90%的粒径小于128nm，粒径比BSANP略为增大。_中国科技论文在线图1 叶酸偶联白蛋白纳米粒的透射电镜照片 Figure 1 Transmission electron micrography of folate-conjugated bovine serum albumin nanoparticles (folate-BSANP) (×20000)2.2 Folate-BSANP偶联程度的测定 5批folate-BSANP样品表面

15、的叶酸偶联量测定数值分别为172、176、162、163、172mol/gBSA，故其平均叶酸偶联量为169mol/gBSA。作者采用2,4,6-三硝基苯磺酸显色法3测定了BSANP的表面活性氨基的含量为598mol/gBSA，则偶联于folate-BSANP表面的叶酸密度为28.3%。2.3 Folate-BSANP与BSANP的细胞摄取实验纳米粒浓度对SKOV3细胞摄取的影响见图2，由图可见随着培养液中folate-BSANP浓度的增加，SKOV3细胞摄取folate-BSANP的量逐渐增加，但当浓度大于1.0mg/ml后，增加缓慢。在极低浓度时，BSANP的细胞摄取量几乎为零。图2 纳米

16、粒浓度对skvo3细胞摄取叶酸偶联白蛋白纳米粒的影响Figure 2 Concentration dependence of Folate-BSANP uptake bySKOV3 cells培养时间对SKOV3细胞摄取的影响见图3，随着培养时间的延长，SKOV3细胞摄取folate-BSANP的量逐渐增加，在初始的2h内，细胞摄取量增加迅速，在随后的培养时间内增加缓慢。图3 培养时间对SKOV3细胞摄取叶酸偶联白蛋白纳米粒的影响Figure 3 Time dependence of folate-BSANP uptake by SKOV3cells游离叶酸对SKOV3细胞摄取的影响见图4，随

17、着外源性叶酸的加入，SKOV3细胞对Folate-BSANP的摄取量逐渐减少，并最终接近BSANP的摄取量；而相同情况下，SKOV3细胞对BSANP的摄取曲线非常平缓。图4 游离叶酸对SKOV3细胞摄取叶酸偶联白蛋白纳米粒的抑制Figure 4 Inhibition of free folic acid on the uptake offolate-BSANP由图5可以看到，SKOV3细胞与folate-BSANP 37培养3h后在荧光显微镜下可以看到明显的荧光，而_中国科技论文在线SKOV3细胞与BSANP培养后在荧光显微镜下基本上看不到荧光，说明SKOV3细胞摄入folate-BSANP的

18、量远大于BSANP。AB图 SKOV细胞与Folate-BSANP和BSANP培养3h后的荧光显微镜照片Figure 5 Fluorescence micrographs of SKOV3 cells incubated respectively with folate-BSANP and BSANP for 3h at 37(×400)A：folate-BSANP; B：BSANP3 讨论受体和其配体的结合具有特异性、选择性、饱和性、亲合力强和生物效应明显等特点。利用配体为药物或放射性核素的载体，通过受体介导作用，增加药物在病灶局部的浓度、提高疗效，降低毒副作用，达到靶向治疗目的，

19、是目前研究最活跃的前沿领域之一。叶酸受体在多种肿瘤细胞(如卵巢癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌和肾细胞癌等)膜上的高表达为通过叶酸受体介导药物靶向于肿瘤细胞的研究奠定了基础。我们先制备BSANP，利用叶酸活性酯与BSANP表面的活性氨基进行偶联反应，制备folate-BSANP，平均粒径为66nm，偶联于folate-BSANP表面的叶酸密度为28.3%。研究结果显示folate-BSANP进入SKOV3细胞的量显著高于BSANP，两者摄入途径不同。folate-BSANP被SKOV3细胞摄入的量随浓度增大、时间延长而增加，但在浓度超过1.0mg/ml，时间超过2h后增加缓慢，表现出摄取过程具有浓度

20、和时间依赖的饱和特点；folate-BSANP摄入量随SKOV3细胞培养介质中游离叶酸浓度的增加而明显降低，表现为叶酸对folate-BSANP的摄入具有竞争性抑制作用（在生理条件下，叶酸浓度一般不会超过20nmol/L，不会干扰folate-BSANP的摄取而影响靶向效果4）。由此可见，folate-BSANP是通过叶酸受体介导而进入SKOV3肿瘤细胞的。用作抗癌药物载体是纳米粒最有价值的用途之一。纳米粒能从肿瘤的内皮组织、血管中溢出而滞留在肿瘤内，肿瘤的血管壁对纳米粒有黏附性。纳米级胶体颗粒在体内的命运主要由它们的体积和表面特性决定。较小的体积(小于200nm)和亲水性的表面可以减少调理反应，从而使其不易被巨噬细胞吞噬5。我们采用亲水性材料牛血清白蛋白制备的叶酸偶联白蛋白纳米粒平均粒径为66nm，符合上述两个条件，可以有效地逃避巨噬细胞的吞噬，到达肿瘤组织。白蛋白纳米粒表面偶联的叶酸分子可以和肿瘤细胞膜表面高表达的叶酸受体作用，有效地将药物输送到肿瘤细胞。利用叶酸受体在多种肿瘤细胞表面高表达的特点，使其具有主动靶向作用，以期提高白蛋白纳米粒的肿瘤细胞摄取量。叶酸受体介导的白蛋白纳米粒可用于治疗卵巢癌、结肠直肠癌、乳腺癌、肺癌和肾细胞癌等多种肿瘤，具有诱人的应用前景。本研究首次成功制备得到叶酸偶联白蛋白纳米粒，探讨了其体外肿瘤细胞靶