第2章色谱分析导论

1、第二章第二章 色谱分析方法导论色谱分析方法导论一、一、 概述概述 历史、色谱分离过程、分类历史、色谱分离过程、分类二、色谱流出曲线二、色谱流出曲线 色谱图及相关术语色谱图及相关术语三、色谱法基本原理三、色谱法基本原理 描述分配过程参数、峰间距、峰形状和峰宽的理论描述描述分配过程参数、峰间距、峰形状和峰宽的理论描述(塔板理论及塔板理论及速率理论速率理论)四、分离度及色谱分离方程四、分离度及色谱分离方程 分离度及色谱分离方程、影响分离的因素分离度及色谱分离方程、影响分离的因素五、色谱常用的定性定量方法五、色谱常用的定性定量方法 色谱分析中常采用的定性与定量分析方法色谱分析中常采用的定性与定量分析方

2、法一、一、 概述概述 化学分析方法的基本要求是其选择性要高。即，在分析过程中，待化学分析方法的基本要求是其选择性要高。即，在分析过程中，待测物与潜在的干扰物的分离是最为重要的步骤！测物与潜在的干扰物的分离是最为重要的步骤！20 世纪中期，大量采用一些经典的分离方法：世纪中期，大量采用一些经典的分离方法：沉淀、蒸馏和萃取沉淀、蒸馏和萃取 现代分析中，大量采用现代分析中，大量采用色谱和电泳色谱和电泳分离方法。迄今为止，色谱方法分离方法。迄今为止，色谱方法是最为有效的分离手段，其应用涉及每个科学领域。是最为有效的分离手段，其应用涉及每个科学领域。历史：历史：1903年，俄国植物学家年，俄国植物学家M

3、ikhail Tswett 最先发明。他采用填充有最先发明。他采用填充有固体固体CaCO3细粒子的玻璃柱，将植物色素的混合物（叶绿素和叶黄素细粒子的玻璃柱，将植物色素的混合物（叶绿素和叶黄素 chlorophylls & xanthophylls）加于柱顶端，然后以溶剂淋洗，被）加于柱顶端，然后以溶剂淋洗，被分分 离的组份在柱中显示了不同的色带，他称之为色谱离的组份在柱中显示了不同的色带，他称之为色谱 (希腊语中希腊语中 “chroma”=color; “graphein”=write) 。 50年代，色谱发展最快（一些新型色谱技术的发展；复杂组分分年代，色谱发展最快（一些新型色谱技术

4、的发展；复杂组分分析发展的要求。析发展的要求。 1937-1972年，年，15年中有年中有12个个Nobel奖是有关色谱研究的。奖是有关色谱研究的。A.J.P. Martin R.L.M. Synge 1952年化学Nobel奖开创了气相色谱法。(一一) 色谱分离基本原理：色谱分离基本原理： 使用外力使含有样品的流动相（气体、液体或超临界流体）通过使用外力使含有样品的流动相（气体、液体或超临界流体）通过一固定于柱或平板上、与流动相互不相溶的固定相表面。样品中各组一固定于柱或平板上、与流动相互不相溶的固定相表面。样品中各组份在两相中进行不同程度的作用。与固定相作用强的组份随流动相流份在两相中进行

5、不同程度的作用。与固定相作用强的组份随流动相流出的速度慢，反之，与固定相作用弱的组份随流动相流出的速度快。出的速度慢，反之，与固定相作用弱的组份随流动相流出的速度快。由于流出的速度的差异，使得混合组份最终形成各个单组份的由于流出的速度的差异，使得混合组份最终形成各个单组份的“带带(band)”或或“区区(zone)”，对依次流出的各个单组份物质可分别进行定，对依次流出的各个单组份物质可分别进行定性、定量分析。性、定量分析。(二）色谱分类方法：二）色谱分类方法： 1. 按固定相外形分：按固定相外形分： 柱色谱（填充柱、空心柱）、平板色谱（薄层色谱和纸色谱。柱色谱（填充柱、空心柱）、平板色谱（薄层

6、色谱和纸色谱。 2. 按两相状态分按两相状态分分类分类 方法方法 固定相固定相 平衡类型平衡类型 气液色谱气液色谱 液体吸附液体吸附于于固体固体 气液间分配气液间分配 气固色谱气固色谱 固体吸附剂固体吸附剂 吸附吸附 气气 相相 色色 谱谱 气相键合色谱气相键合色谱 有机组份键合于有机组份键合于固体表面固体表面 液体和键合体液体和键合体表面间的分配表面间的分配 液液色谱液液色谱 液体吸附液体吸附于于固体固体 不相溶液体间不相溶液体间的分配的分配 液固液固 (吸附吸附)色色谱谱 固体吸附剂固体吸附剂 吸附吸附 液相键合色谱液相键合色谱 有机组份键合于有机组份键合于固体表面固体表面 液体和键合体液

7、体和键合体表面间的分配表面间的分配 离子交换色谱离子交换色谱 离子交换树脂离子交换树脂 离子交换离子交换 液液 相相 色色 谱谱 凝胶渗透凝胶渗透(尺寸尺寸排阻排阻)色谱色谱 液体附于多孔聚液体附于多孔聚合物合物 分配分配/筛析筛析 超临界超临界流体流体 有机组份键合于有机组份键合于固固体表面体表面 超临界流体和超临界流体和键合相间键合相间分配分配 3. 按色谱分离的机理分 利用组分在吸附剂（固定相）上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法，称为吸附色谱法。吸附色谱法。 利用组分在固定液（固定相）中溶解度不同而达到分离的方法称为分配色谱法。分配色谱法。 利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小

8、不同而达到分离的方法，称为离子交换色谱法。离子交换色谱法。 利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而达到分离的方法，称为凝胶色谱法凝胶色谱法或空间排阻色谱法。空间排阻色谱法。 最近，又有一种新分离技术，利用不同组分与固定相（固定化分子）的高专属性亲和力进行分离的技术称为亲亲和色谱法，和色谱法，常用于蛋白质的分离。4. 按照展开程序分类 按照展开程序的不同，可将色谱法分为洗脱法、洗脱法、顶替法、和迎头法顶替法、和迎头法。 （1）洗脱法洗脱法也称冲洗法。工作时，首先将样品加到色谱柱头上，然后用吸附或溶解能力比试样组分弱得多的气体或液体作冲洗剂。由于各组分在固定相上的吸附或溶解能力不同，被冲洗剂

9、带出的先后次序也不同，从而使组分彼此分离。流出曲线下图。 这种方法能使样品的各组分获得良好的分离，色谱峰清晰。此外，除去冲洗剂后，可获得纯度较高的物质。目前，这种方法是色谱法中最常用的一种方法。 （2）顶替法顶替法是将样品加到色谱柱头后，在惰性流动相中加入对固定相的吸附或溶解能力比所有试样组分强的物质为顶替剂（或直接用顶替剂作流动相），通过色谱柱，将各组分按吸附或溶解能力的强弱顺序，依次顶替出固定相。很明显，吸附或溶解能力最弱的组分最先流出，最强的最后流出。顶替法的流出曲线如下图。 此法适于制备纯物质或浓缩分离某一组分；其缺点是经一次使用后，柱子就被样品或顶替剂饱和，必须更换柱子或除去被柱子吸

10、附的物质后，才能再使用。 （3）迎头法迎头法是将试样混合物连续通过色谱柱，吸附或溶解能力最弱的组分首先一纯物质的状态流出，其次则以第一组分和吸附或溶解能力较弱的第二组分混合物，以此类推。流出曲线如下图。 该法在分离多组分混合物时，除第一组分外，其余均非纯态，因此仅适用于从含有微量杂质的混合物中切割出一个高纯组分（组分A），而不适用于对混合物进行分离。AA+ B二、二、 色谱流出曲线（色谱图）色谱流出曲线（色谱图） 色谱流出曲线色谱流出曲线 由检测器输出的电信号强度对时间作图，所得曲线称为色谱流出曲线。曲线上突起部分就是色谱峰。 如果进样量很小，浓度很低，在吸附等温线（气固吸附色谱）或分配等温线

11、（气液分配色谱）的线性范围内，则色谱峰是对称的。色谱流出曲线（色谱图）色谱流出曲线（色谱图） 混合组分的分离过程及检测器对各组份在不同阶段的响应混合组分的分离过程及检测器对各组份在不同阶段的响应色谱术语：色谱术语：1）基线：）基线：在实验条件下在实验条件下，色谱柱后仅有纯流动相，色谱柱后仅有纯流动相进入检测器时的流出曲线进入检测器时的流出曲线称为基线，称为基线，S/N大的、稳大的、稳定的基线为水平直线。定的基线为水平直线。2）峰高：）峰高：色谱峰顶点与色谱峰顶点与基线的距离。基线的距离。u0tLu 死时间死时间柱长柱长3）保留值）保留值(Retention value, R) a. 死时间死时

12、间(Dead time, t0) ：不与固定相作用的物质从进样到出现峰极大值时：不与固定相作用的物质从进样到出现峰极大值时的时间，它与色谱柱的空隙体积成正比。由于该物质不与固定相作用，因此，的时间，它与色谱柱的空隙体积成正比。由于该物质不与固定相作用，因此，其流速与流动相的流速相近。据其流速与流动相的流速相近。据 t0 可求出流动相平均流速可求出流动相平均流速 b. 保留时间保留时间tr：试样从进样到出现峰极大值时的时间。它包括组份随流动相：试样从进样到出现峰极大值时的时间。它包括组份随流动相通过柱子的时间通过柱子的时间t0和组份在固定相中滞留的时间。和组份在固定相中滞留的时间。 c. 调整保

13、留时间调整保留时间 ：某组份的保留时间扣除死时间后的保留时间，它是组某组份的保留时间扣除死时间后的保留时间，它是组份在固定相中的滞留时间。即份在固定相中的滞留时间。即 由于时间为色谱定性依据。但同一组份的保留时间与流速有关，因此有时由于时间为色谱定性依据。但同一组份的保留时间与流速有关，因此有时需用保留体积来表示保留值。需用保留体积来表示保留值。 d. 死体积死体积V0：色谱柱管内固定相颗粒间空隙、色谱仪管路和连接头间空隙：色谱柱管内固定相颗粒间空隙、色谱仪管路和连接头间空隙和检测器间隙的总和。勿略后两项可得到：和检测器间隙的总和。勿略后两项可得到：其中，其中，Fco为柱出口的载气流速为柱出口

14、的载气流速（mL/min)，其值为：，其值为：F0-检测器出口流速；检测器出口流速；Tr-室温；室温；Tc-柱温；柱温；p0-大气压；大气压；pw-室温时水蒸汽压。室温时水蒸汽压。rt0rrttt co00FtV 0w0rc0copppTTFF e. 保留体积保留体积Vr：指从进样到待测物在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相指从进样到待测物在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。的体积。 f. 调整保留体积调整保留体积 ：某组份的保留体积扣除死体积后的体积。某组份的保留体积扣除死体积后的体积。 g. 相对保留值相对保留值r2,1：组份组份2的调整保留值与组份的调整保留值与组份1的调整保留值

15、之比。的调整保留值之比。注意：注意： r2,1只与柱温和固定相性质有关，而与柱内径、柱长只与柱温和固定相性质有关，而与柱内径、柱长L、填充情况及流动相、填充情况及流动相流速无关，因此，在色谱分析中，尤其是流速无关，因此，在色谱分析中，尤其是GC中广泛用于定性的依据！中广泛用于定性的依据！具体做法：固定一个色谱峰为标准具体做法：固定一个色谱峰为标准s，然后再求其它峰，然后再求其它峰 i 对标准峰的相对保留值对标准峰的相对保留值，此时以，此时以 表示：表示： 1, 又称又称选择因子选择因子(Selectivity factor)。cor0FtV rVcor0rrFtVVV 1r2r1r2r1 ,

16、2VVttr )s(t)i (tsr h. 区域宽度：区域宽度：用于衡量柱效及反映色谱操作条件下的动力学因素。通常有用于衡量柱效及反映色谱操作条件下的动力学因素。通常有三种表示方法：三种表示方法： 标准偏差标准偏差 ：0.607倍峰宽处的一半。倍峰宽处的一半。 半峰宽半峰宽W1/2：峰高一半处的峰宽。峰高一半处的峰宽。W1/2=2.354 峰底宽峰底宽W：色谱峰两侧拐点上切线与基线的交点间的距离。色谱峰两侧拐点上切线与基线的交点间的距离。W= 4 色谱流出曲线的意义：色谱流出曲线的意义： 色谱峰数色谱峰数=样品中单组份的最少个数；样品中单组份的最少个数； 色谱保留值色谱保留值定性依据；定性依据

17、； 色谱峰高或面积色谱峰高或面积定量依据；定量依据； 色谱保留值或区域宽度色谱保留值或区域宽度色谱柱分离效能评价指标；色谱柱分离效能评价指标； 色谱峰间距色谱峰间距固定相或流动相选择是否合适的依据。固定相或流动相选择是否合适的依据。三、三、 色谱法基本原理色谱法基本原理两组份峰间距足够远：由各组份在两相间的分配系数决定，即由色谱过程的两组份峰间距足够远：由各组份在两相间的分配系数决定，即由色谱过程的 热力学热力学性质决定。性质决定。每个组份峰宽足够小：由组份在色谱柱中的传质和扩散决定，即由色谱过程每个组份峰宽足够小：由组份在色谱柱中的传质和扩散决定，即由色谱过程 动力学动力学性质决定。性质决定

18、。 因此，研究、解释色谱分离行为应从热力学和动力学两方面进行。因此，研究、解释色谱分离行为应从热力学和动力学两方面进行。（一）描述分配过程的参数（一）描述分配过程的参数 分配系数分配系数(Distribution constant, K)： 描述组份在固定相和流动相间的分配过程或吸附描述组份在固定相和流动相间的分配过程或吸附-脱附过程的参数，称脱附过程的参数，称为分配系数。为分配系数。1.K 只与固定相和温度有关，与两相体积、柱管特性和所用仪器无关。只与固定相和温度有关，与两相体积、柱管特性和所用仪器无关。msccK 溶质在流动相中的浓度溶质在流动相中的浓度溶质在固定相中的浓度溶质在固定相中的

19、浓度2. 分配比分配比(Retention factor or capacity factor, k)： 在一定温度和压力下，组份在两相间的分配达平衡时，分配在固定相和在一定温度和压力下，组份在两相间的分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比，称为分配比它反映了组分在柱中的迁移速率。又称保留流动相中的质量比，称为分配比它反映了组分在柱中的迁移速率。又称保留因子。因子。其中其中Vm V0，Vs为固定相体积。为固定相体积。分配比分配比 k 的求算：的求算： 1）组分滞留因子：）组分滞留因子： 2）又，）又， 3）因此，）因此，mmssmsVcVcmmk 组组分分在在流流动动相相中中的的质质量量

20、组组分分在在固固定定相相中中的的质质量量k11mmmuuRsmmss 流动相线速度流动相线速度组分线速度组分线速度0rstLu，tLu 0r0r00r0rVVtttttk)k1(tt 或或3. K 与与 k 的关系：的关系： 称为称为相比率相比率，它也是反映色谱柱柱型特点的参数。，它也是反映色谱柱柱型特点的参数。对填充柱，对填充柱， =635；对毛细管柱，；对毛细管柱， =60600。4. 选择因子选择因子 ：色谱柱对色谱柱对A、B两组分的选择因子两组分的选择因子 定义如下：定义如下：A为先流出的组分，为先流出的组分，B为后流出的组分。为后流出的组分。 kVVkV/mV/mccKsmmmssm

21、sABABrrKKkk)A(t)B(t 4. 分配系数分配系数 K 及分配比及分配比 k 与选择因子与选择因子的关系的关系 对对A、B两组分的选择因子，用下式表示：两组分的选择因子，用下式表示： = tr (B) / tr (A) = k（A） / k（B） =K（A） / K（B）注意：注意：K 或或 k 反映的是某一组分在两相间的分配；而反映的是某一组分在两相间的分配；而 是反映两组分间是反映两组分间的分离情况！当两组分的分离情况！当两组分 K 或或 k 相同时，相同时， =1 时，两组分不能分开；当两时，两组分不能分开；当两组分组分 K 或或 k 相差越大时，相差越大时， 越大，分离得越

22、好。也就是说，两组分在两越大，分离得越好。也就是说，两组分在两相间的分配系数不同，是色谱分离的先决条件。相间的分配系数不同，是色谱分离的先决条件。 和和 k 是计算色谱柱分离效能的重要参数！是计算色谱柱分离效能的重要参数！(热力学和动力学的结合热力学和动力学的结合) 下图是下图是 A、B两组分沿色谱柱移动时，不同位置处的浓度轮廓。两组分沿色谱柱移动时，不同位置处的浓度轮廓。KA KBABAB浓度沿柱移动距离 L溶质A和B在沿柱移动时不同位置处的浓度轮廓 图中图中KAKB ，因此，因此，A组分在移动过程中滞后。随着两组分在色谱柱中组分在移动过程中滞后。随着两组分在色谱柱中移动距离的增加，两峰间的

23、距离逐渐变大，同时，每一组分的浓度轮廓（即区移动距离的增加，两峰间的距离逐渐变大，同时，每一组分的浓度轮廓（即区域宽度）也慢慢变宽。显然，区域扩宽对分离是不利的，但又是不可避免的。域宽度）也慢慢变宽。显然，区域扩宽对分离是不利的，但又是不可避免的。若要使若要使A、B组分完全分离，必须满足以下三点：组分完全分离，必须满足以下三点： 第一，两组分的分配系数必须有差异；第一，两组分的分配系数必须有差异；(热力学特性热力学特性) 第二，区域扩宽的速率应小于区域分离的速度；第二，区域扩宽的速率应小于区域分离的速度；(动力学特性动力学特性) 第三，在保证快速分离的前提下，提供足够长的色谱柱。第三，在保证快

24、速分离的前提下，提供足够长的色谱柱。 第一、二点是完全分离的必要条件。作为一个色谱理论，它不仅应说明组第一、二点是完全分离的必要条件。作为一个色谱理论，它不仅应说明组分在色谱柱中移动的速率，而且应说明组分在移动过程中引起区域扩宽的各种分在色谱柱中移动的速率，而且应说明组分在移动过程中引起区域扩宽的各种因素。塔板理论和速率理论均以色谱过程中分配系数恒定为前提，故称为因素。塔板理论和速率理论均以色谱过程中分配系数恒定为前提，故称为线线性色谱理论。性色谱理论。（二）峰间距、峰形状和峰宽的理论描述（二）峰间距、峰形状和峰宽的理论描述1. 塔板理论（塔板理论（Plate theory) 1952年，年，

25、Martin等人提出的塔板理论将一根色谱柱当作一个由许多塔板组等人提出的塔板理论将一根色谱柱当作一个由许多塔板组成的精馏塔，用塔板概念来描述组分在柱中的分配行为。塔板是从精馏中借用成的精馏塔，用塔板概念来描述组分在柱中的分配行为。塔板是从精馏中借用的，是一种半经验理论，但它成功地解释了色谱流出曲线呈正态分布。的，是一种半经验理论，但它成功地解释了色谱流出曲线呈正态分布。 塔板理论假定：塔板理论假定： 1）塔板之间不连续；）塔板之间不连续； 2）塔板之间无分子扩散；）塔板之间无分子扩散； 3）组分在各塔板内两相间的分配瞬间达至平衡，达一次平衡所需柱长为）组分在各塔板内两相间的分配瞬间达至平衡，达

26、一次平衡所需柱长为理论塔板高度理论塔板高度H； 4）某组分在所有塔板上的分配系数相同；）某组分在所有塔板上的分配系数相同； 5）流动相以不连续方式加入，即以一个一个的塔板体积加入。）流动相以不连续方式加入，即以一个一个的塔板体积加入。 当塔板数当塔板数n较少时，组分在柱内达分配平衡的次数较少，流出曲线呈峰形，较少时，组分在柱内达分配平衡的次数较少，流出曲线呈峰形，但不对称；当塔板数但不对称；当塔板数n50 时，峰形接近正态分布。时，峰形接近正态分布。 根据呈正态分布的色谱流出曲线可以导出计算塔板数根据呈正态分布的色谱流出曲线可以导出计算塔板数n的公式，用以评价一根柱的公式，用以评价一根柱子的柱

27、效。由于色谱柱并无真正的塔板，故塔板数又称子的柱效。由于色谱柱并无真正的塔板，故塔板数又称理论塔板数：理论塔板数：可见理论塔板数由组分保留值和峰宽决定。可见理论塔板数由组分保留值和峰宽决定。 若柱长为若柱长为L，则每块，则每块理论塔板高度理论塔板高度H为为由上述两式知道，理论塔板数由上述两式知道，理论塔板数n越多、理论塔板高度越多、理论塔板高度H越小、色谱峰越窄，则柱效越小、色谱峰越窄，则柱效越高。越高。 但上述两式包含死时间但上述两式包含死时间t0，它与组分在柱内的分配无关，因此不能真正反映色，它与组分在柱内的分配无关，因此不能真正反映色谱柱的柱效。通常以谱柱的柱效。通常以有效塔板数有效塔板

28、数neff 和和有效塔板高度有效塔板高度Heff 表示：表示：2r22/1r)Wt(16)Wt(54. 5n nLH effeff2r22/1reffnLH)Wt(16)Wt(54. 5n 有关塔板理论的说明：有关塔板理论的说明： 1）说明柱效时，必须注明该柱效是针对何种物质、固定液种类及其含）说明柱效时，必须注明该柱效是针对何种物质、固定液种类及其含量、流动相种类及流速、操作条件等；量、流动相种类及流速、操作条件等； 2）应定期对柱效进行评价，以防柱效下降、延长柱寿命。）应定期对柱效进行评价，以防柱效下降、延长柱寿命。 3）塔板理论描述了组分在柱内的分配平衡和分离过程、导出流出曲线）塔板理论

29、描述了组分在柱内的分配平衡和分离过程、导出流出曲线的数学模型、解释了流出曲线形状和位置、提出了计算和评价柱效的参数。的数学模型、解释了流出曲线形状和位置、提出了计算和评价柱效的参数。 但该理论是在理想情况下导出的，未考虑分子扩散因素、其它动力学因但该理论是在理想情况下导出的，未考虑分子扩散因素、其它动力学因素对柱内传质的影响。因此它不能解释：素对柱内传质的影响。因此它不能解释：v 峰形为什么会扩张？峰形为什么会扩张？v 影响柱效（板高）的动力学因素是什么？影响柱效（板高）的动力学因素是什么？v 不同的流动相流速下为什么具有不同的柱效？不同的流动相流速下为什么具有不同的柱效？2. 速率理论（速率

30、理论（Rate theory） 1956年，荷兰化学工程师年，荷兰化学工程师van Deemter提出了色谱过程动力学速率理提出了色谱过程动力学速率理论：吸收了塔板理论中的板高论：吸收了塔板理论中的板高H概念，考虑了组分在两相间的扩散和传概念，考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，从而给出了质过程，从而给出了van Deemter方程：方程： u 为流动相线速度；为流动相线速度； A，B，C为常数，其中为常数，其中 A分别表示涡流扩散系数；分别表示涡流扩散系数； B分子扩散系数；分子扩散系数； C传质阻力系数（包括液相和固相传质阻力系数）。传质阻力系数（包括液相和固相传质阻力系数）。 该式从动力

31、学角度很好地解释了影响板高（柱效）的各种因素！任该式从动力学角度很好地解释了影响板高（柱效）的各种因素！任何减少方程右边三项数值的方法，都可降低何减少方程右边三项数值的方法，都可降低H，从而提高柱效。，从而提高柱效。CuuBAH 1）涡流扩散项）涡流扩散项(Multipath term, A) 在填充柱中，由于受到固定相颗粒的阻碍，组份在填充柱中，由于受到固定相颗粒的阻碍，组份在迁移过程中随流动相不断改变方向，形成紊乱的在迁移过程中随流动相不断改变方向，形成紊乱的“涡流涡流”：从图中可见，因填充物颗粒大小及填充：从图中可见，因填充物颗粒大小及填充的不均匀性的不均匀性同一组分运行路线长短不同同一

32、组分运行路线长短不同流流出时间不同出时间不同峰形展宽。峰形展宽。展宽程度以展宽程度以A表示：表示：A=2 dp其中其中dp填充物平均直径；填充物平均直径； 填充不规则因子。填充不规则因子。 可见，使用细粒的固定相并填充均匀可减小可见，使用细粒的固定相并填充均匀可减小A，提高柱效。对于空心毛细，提高柱效。对于空心毛细管柱，无涡流扩散，即管柱，无涡流扩散，即A=0。流动方向流动方向2）分子扩散项）分子扩散项(Longitudinal diffusion term, B/u) 纵向分子扩散是由于浓度梯度引起的。当样品被注入色谱柱时，它呈纵向分子扩散是由于浓度梯度引起的。当样品被注入色谱柱时，它呈“塞

33、塞子子”状分布。随着流动相的推进，状分布。随着流动相的推进， “塞子塞子”因浓度梯度而向前后自发地扩散因浓度梯度而向前后自发地扩散，使谱峰展宽。其大小为，使谱峰展宽。其大小为B=2 D 称为弯曲因子，它表示固定相几何形状对自由分子扩散的阻碍情况；称为弯曲因子，它表示固定相几何形状对自由分子扩散的阻碍情况；D组分在流动相中的扩散系数。组份为气体或液体时，分别以组分在流动相中的扩散系数。组份为气体或液体时，分别以Dg或或Dm表示；表示；讨论：讨论：q 分子量大的组分，分子量大的组分，Dg小，即小，即B小小q Dg 随柱温升高而增加，随柱压降低而减小；随柱温升高而增加，随柱压降低而减小；q 流动相分

34、子量大，流动相分子量大，Dg 小，即小，即 B 小；小；q u 增加，组份停留时间短，纵向扩散小；增加，组份停留时间短，纵向扩散小；（B/u）q 对于液相色谱，因对于液相色谱，因Dm 较小，较小，B 项可勿略。项可勿略。)M/1D(g流动相流动相因为因为 球状颗粒；球状颗粒；大分子量流动相；大分子量流动相；适当增加流速；适当增加流速；短柱；短柱；低温。低温。2）分子扩散项）分子扩散项(Longitudinal diffusion term, B/u) 纵向分子扩散使峰展宽 （a）柱内谱带构形 （b）相应的响应信号 （a）（b）3）传质阻力项）传质阻力项(Mass-transfer term,

35、Cu) 因传质阻力的存在，使分配不能因传质阻力的存在，使分配不能“瞬间瞬间”达至平衡，因此产生峰形展宽。气达至平衡，因此产生峰形展宽。气相色谱以气体为流动相，液相色谱以液体为流动相，二者传质过程不完全相同相色谱以气体为流动相，液相色谱以液体为流动相，二者传质过程不完全相同。下面分别作讨论。下面分别作讨论。a）气液色谱：传质阻力项）气液色谱：传质阻力项C包括气相传质阻力系数包括气相传质阻力系数Cs和液相传质阻力系数和液相传质阻力系数Cl。Dd)k1(k32Dd)k1(k01. 0CCCl2f2g2p22lg 流动相流动相固液界面固液界面固定固定液液组分分子组分分子ClCg讨论：讨论：F 减小填充

36、颗粒直径减小填充颗粒直径dp；F 采用分子量小的流动相，使采用分子量小的流动相，使Dg增加；增加；F 减小液膜厚度减小液膜厚度df，Cl下降。下降。但此时但此时k又减小。又减小。 因此，当保持固定液含量不变时，可通过因此，当保持固定液含量不变时，可通过 增加固定液载体的比表面来降低增加固定液载体的比表面来降低df。但比。但比 表面过大又会因吸附过强使峰拖尾。表面过大又会因吸附过强使峰拖尾。F 增加柱温，可增加增加柱温，可增加Dl，但，但k值也减小，为保值也减小，为保 持合适持合适Cl值，应控制柱温。值，应控制柱温。b）液液色谱：传质阻力项）液液色谱：传质阻力项C包括流动相传质阻力系数包括流动相

37、传质阻力系数Cm和固定相传质阻和固定相传质阻力系数力系数Cs。讨论：讨论：v 流动相传质阻力包括两方面：流动相中的传质阻力流动相传质阻力包括两方面：流动相中的传质阻力Cm、滞留的流动相、滞留的流动相传质阻传质阻Cs力。分别与填充物大小力。分别与填充物大小 dp、扩散系数、扩散系数(Dm)、微孔大小及其数量等、微孔大小及其数量等有关。有关。 因此，降低流动相传质阻力的方法有：细颗粒固定相、增加组分在固因此，降低流动相传质阻力的方法有：细颗粒固定相、增加组分在固定相和流动相中的扩散系数定相和流动相中的扩散系数D、适当降低线速度、短柱。、适当降低线速度、短柱。v 固定相传质阻力与液膜厚度固定相传质阻

38、力与液膜厚度df、保留因子、保留因子 k 和扩散系数和扩散系数Ds等有关。等有关。 因此，降低固定相传质阻力的方法有：与气液色谱中的表述相同。因此，降低固定相传质阻力的方法有：与气液色谱中的表述相同。s2fsm2psmmsmDdDd)(CCC sm4）流速）流速u 由由van Deemter方程方程 H = A + B/u + Cu知道：知道： 当当u一定时，仅在一定时，仅在A、B、C较小时，较小时，H较小，柱效较高；反之则柱效较低，较小，柱效较高；反之则柱效较低，色谱峰将展宽。色谱峰将展宽。 以以u对对H作图，可得作图，可得H-u曲线（如图），从该曲线得到：曲线（如图），从该曲线得到：C/B

39、 BC2A 涡流扩散项涡流扩散项A与流速与流速u无关；无关；低流速区低流速区(u小小)，B/u大，分子扩散项占主导，大，分子扩散项占主导， 此时选择分子量大的气体如此时选择分子量大的气体如N2和和Ar为载气，可为载气，可 减小扩散，提高柱效；减小扩散，提高柱效； 高流速区高流速区(u大大)，Cu大，传质阻力项占主导，大，传质阻力项占主导， 此时选择分子量小的气体如此时选择分子量小的气体如H2和和He为载气，为载气， 可增加扩散系数，提高柱效；可增加扩散系数，提高柱效； 曲线的最低点对应最佳线速曲线的最低点对应最佳线速uopt( ) 下的下的 最小板高最小板高Hmin( )； LC的的Hmin和

40、和uopt均比均比GC的小一个数量级，即在的小一个数量级，即在 LC中，较低流速可获得较大的柱效。中，较低流速可获得较大的柱效。板高，板高，H(cm)HminA+B/u+CuCmuCsuAB/u5）固定相颗粒大小对板高的影响）固定相颗粒大小对板高的影响 实验表明，颗粒越细，板高越小，受线速影响越小。即，在实验表明，颗粒越细，板高越小，受线速影响越小。即，在HPLC分析中采分析中采用细粒作固定相的理论根据！用细粒作固定相的理论根据！ 但颗粒细导致柱流速慢，当采用高压技术，才能实现但颗粒细导致柱流速慢，当采用高压技术，才能实现HPLC的分析要求。的分析要求。 上面分别介绍了影响色谱分离的基本原理以

41、及影响柱效的各种因素，但是上面分别介绍了影响色谱分离的基本原理以及影响柱效的各种因素，但是如何从总体上定量描述色谱分离效能？如何将各种影响因素对分离的影响定量如何从总体上定量描述色谱分离效能？如何将各种影响因素对分离的影响定量地表述出来呢？地表述出来呢？板高板高, H(cm)四、四、 分离度及色谱分离方程分离度及色谱分离方程（一）分离度（一）分离度(Resolution, R) 同时反映色谱柱效能和选择性的一个综合指标。也称总分离效能指标或同时反映色谱柱效能和选择性的一个综合指标。也称总分离效能指标或分分辨率。辨率。其定义为：其定义为： 利用此式，可直接从色谱流出曲线上求出分离度利用此式，可直

42、接从色谱流出曲线上求出分离度R。 R 越大，相邻组分分离越好。当越大，相邻组分分离越好。当R=1.5时，分离程度可达时，分离程度可达99.7%，因此，因此R=1.5通常用作是否分开的判据。通常用作是否分开的判据。W)tt (WW)tt (2)WW(21ttR121212rr21rr21rr R=1.5R=0.75R=1.0响应信号保留时间保留时间 t, min)1(4nR)k1k)(1(4nReff 或或（二）色谱分离方程（二）色谱分离方程 R 的定义并未反映影响分离度的各种因素。也就是说，的定义并未反映影响分离度的各种因素。也就是说，R 未与影响其大小未与影响其大小的因素：柱效的因素：柱效n

43、、选择因子、选择因子 和保留因子和保留因子 k 联系起来。联系起来。 对于相邻的难分离组分，由于它们的分配系数对于相邻的难分离组分，由于它们的分配系数 K 相差小，可合理假设相差小，可合理假设k1 k2=k，W1 W2=W。因此可导出。因此可导出R与与n（neff）、）、 和和 k 的关系：的关系：k1k14nkk1114nk)k1(k)kk(4n)k1(t)kk(t4nt2)tt (24nR WW)tt (2R)k1(ttt14nW1)Wt16(n 222221220120rrr21rr0rrr21212 ：并整理如下并整理如下代入到代入到将上式及将上式及因因附：附：具体推导过程如下：具体推

44、导过程如下：有关色谱方程的讨论：有关色谱方程的讨论：1）分离度）分离度R与柱效的关系与柱效的关系 分离度分离度R与理论塔板数与理论塔板数n有关，即有关，即R受热力学性质的影响。受热力学性质的影响。 对具一定相对保留值对具一定相对保留值 的物质对，的物质对，R与有效塔板数与有效塔板数neff有关，说明有关，说明neff可正确代可正确代表柱效能。表柱效能。 由色谱方程可得：由色谱方程可得： 因此可通过增加柱长提高分离度。然而，分析时间也相应增加，且峰宽也展因此可通过增加柱长提高分离度。然而，分析时间也相应增加，且峰宽也展宽！宽！为提高柱效，用减小塔板高度为提高柱效，用减小塔板高度H的方法比增加柱长

45、更有效。的方法比增加柱长更有效。2）分离度）分离度R与保留因子与保留因子 的关系的关系 越大，柱选择性越好，对分离有利。越大，柱选择性越好，对分离有利。 的微小变化可引起的微小变化可引起 R 较大改变。如较大改变。如当当 从从1.01增加至增加至1.10(增加增加9%)时，时，R 则增加则增加 9 倍倍(但但 1.5, R增加不大增加不大) 。 改变改变 的方法有：降低柱温、改变流动相及固定相的性质和组成。的方法有：降低柱温、改变流动相及固定相的性质和组成。 3）分离度）分离度R分配比分配比k的关系的关系 k增加，分离度增加，分离度R增加，但当增加，但当k10，则，则R的增加不明显。通常的增加

46、不明显。通常k在在210之间。之间。 改变改变 k 的方法有：增加柱温的方法有：增加柱温(GC)、流动相性质和组成、流动相性质和组成(LC)以及固定相含量。以及固定相含量。 2121221LLnn)RR( 70%CH3OH+30H2O60%CH3OH+40H2O50%CH3OH+50H2O40%CH3OH+60H2O溶剂溶剂( (流动相流动相) )组成对色谱分离的影响组成对色谱分离的影响1：9,10-蒽醌；蒽醌；2：2-甲基甲基-9,10-蒽醌；蒽醌；3：2-乙基乙基-9,10-蒽醌蒽醌4：1,4-二甲基二甲基-9,10-蒽醌；蒽醌；5：2-特丁基甲基特丁基甲基-9,10-蒽醌；蒽醌；改变组成

47、 使 k 最佳色谱分离中的问题色谱分离中的问题 由于分析物组成复杂，以某组成的流动相可能使部分待测物得到好的分离，由于分析物组成复杂，以某组成的流动相可能使部分待测物得到好的分离，但同时出使其它待测物的分离不令人满意！实际工作中采用程序升温但同时出使其它待测物的分离不令人满意！实际工作中采用程序升温（GC）和梯和梯度淋洗度淋洗（LC）来解决这个问题。来解决这个问题。参数参数 符号符号 测定或计算测定或计算 死时间死时间(迁移时间迁移时间)，不参，不参与分配组分与分配组分 0t 色色谱谱图图 保留时间，组分保留时间，组分 1 和和 2 21rrt，t 色色谱谱图图 调整保留时间，组分调整保留时间

48、，组分 1 r1t 0rrttt11 峰宽，组分峰宽，组分 1 和和 2 W1，W2 色色谱谱图图 柱长柱长 L 直接直接测测量量 流速流速 Fco 直接直接测测量量 流流(固固)定相体积定相体积 Vm，Vs 填填充充制制备备记录记录 流流(固固)定相浓度定相浓度 cm，cs 分析分析和和制制备备记录记录 概念、表示方法及计算公式汇总概念、表示方法及计算公式汇总表表-1参数参数 符号符号 测定或计算测定或计算 线速线速 0t /Lu 流动相体积流动相体积 co0mFtV 保留因子保留因子 00rt/)tt (k msVKVk 分配系数分配系数 smVkVK msccK 选择因子选择因子 0r0

49、rtttt12 1212KKkk 分离度分离度 211r2rWW)tt(2R )k1k)(1(4nR 塔板数塔板数 2r)Wt(16n 222)kk1()1(R16n 板高板高 NLH 保留保留(分析分析)时间时间 2322rk)k1()1(uHR16t 表表-2五、色谱定性和定量分析五、色谱定性和定量分析（一（一 ）色谱的定性分析）色谱的定性分析 色谱定性分析就是要确定各色谱峰所代表的化合物。由于各种色谱定性分析就是要确定各色谱峰所代表的化合物。由于各种物质在一定的色谱条件下均有确定的保留值，因此保留值可作为一物质在一定的色谱条件下均有确定的保留值，因此保留值可作为一种定性指标。目前各种色谱

50、定性方法都是基于保留值的。但是不同种定性指标。目前各种色谱定性方法都是基于保留值的。但是不同物质在同一色谱条件下，可能具有相似或相同的保留值，即物质在同一色谱条件下，可能具有相似或相同的保留值，即保留保留值并非专属值并非专属的。因此仅根据保留值对一个完全未知的样品定性的。因此仅根据保留值对一个完全未知的样品定性是困难的。如果在了解样品的来源、性质、分析目的的基础上，对是困难的。如果在了解样品的来源、性质、分析目的的基础上，对样品组成作初步的判断，再结合下列的方法则可确定色谱峰所代表样品组成作初步的判断，再结合下列的方法则可确定色谱峰所代表的化合物。的化合物。1. 利用纯物质对照定性利用纯物质对

51、照定性 在一定的色谱条件下，一个未知物只有一个确定的保留时间。在一定的色谱条件下，一个未知物只有一个确定的保留时间。因此将已知纯物质在相同的色谱条件下的保留时间与未知物的保留因此将已知纯物质在相同的色谱条件下的保留时间与未知物的保留时间进行比较，就可以定性鉴定未知物。若二者相同，则未知物可时间进行比较，就可以定性鉴定未知物。若二者相同，则未知物可能是已知的纯物质；不同，则未知物就不是该纯物质。能是已知的纯物质；不同，则未知物就不是该纯物质。 纯物质对照法定性只适用于组分性质已有所了解，组成比较简纯物质对照法定性只适用于组分性质已有所了解，组成比较简单，且有纯物质的未知物。单，且有纯物质的未知物

52、。2. 相对保留值法相对保留值法 相对保留值is 是指组分i与基准物质s调整保留值的比值 is = tri / trS= Vri / Vrs 它仅随固定液及柱温变化而变化，与其它操作条件无关。 相对保留值测定方法：在某一固定相及柱温下，分别测出组分i和基准物质s的调整保留值，再按上式计算即可。3. 加入已知物增加峰高法加入已知物增加峰高法 当未知样品中组分较多，所得色谱峰过密，用上述方法不易辨当未知样品中组分较多，所得色谱峰过密，用上述方法不易辨认时，或仅作未知样品指定项目分析时均可用此法。首先作出未知样认时，或仅作未知样品指定项目分析时均可用此法。首先作出未知样品的色谱图，然后在未知样品加入

53、某已知物，又得到一个色谱图。峰品的色谱图，然后在未知样品加入某已知物，又得到一个色谱图。峰高增加的组分即可能为这种已知物。高增加的组分即可能为这种已知物。 4. 保留指数定性法保留指数定性法 保留指数又称为柯瓦（保留指数又称为柯瓦（Kovts）指数，它表示物质在固定液上的保）指数，它表示物质在固定液上的保留行为，是目前使用最广泛并被国际上公认的定性指标。它具有重现性留行为，是目前使用最广泛并被国际上公认的定性指标。它具有重现性好、标准统一及温度系数小等优点。好、标准统一及温度系数小等优点。 保留指数也是一种相对保留值，它是把正构烷烃中某两个组分的调保留指数也是一种相对保留值，它是把正构烷烃中某

54、两个组分的调整保留值的对数作为相对的尺度，并假定正构烷烃的保留指数为整保留值的对数作为相对的尺度，并假定正构烷烃的保留指数为n 100。被测物的保留指数值可用内插法计算被测物的保留指数值可用内插法计算。内插法求IiX示意图信号 tR(Z) tR(i) tR(Z+1) t进样 例如，若确定物质i在某固定液X上的保留指数IiX 的数值。先选取两个正构烷烃作为基准物质，其中一个的碳数为Z，另一个为Z+1，它们的调整保留时间分别为tR(Z) 和 tR(Z+1) ，使被测物质i的调整保留时间tR(i)恰好于两者之间，即tR(Z) tR(i) tR(Z+1) 。将含物质i和所选的两个正构烷烃的混合物注入其

55、固定液X的色谱柱，在一定温度条件下绘制色谱图。 大量实验数据表明，化合物调整保留时间的对数值与其保留指数间的关系基本上大量实验数据表明，化合物调整保留时间的对数值与其保留指数间的关系基本上是一条直线关系。据此，可用内插法求算是一条直线关系。据此，可用内插法求算IiX 。 IiX = 100Z +（lg t R(i) - lg t R(Z)）/（lg t R(Z+1) - lg t R(Z)） 保留指数的物理意义在于：它是与被测物质具有相同调整保留时间的假想的正保留指数的物理意义在于：它是与被测物质具有相同调整保留时间的假想的正构烷烃的碳数乘以构烷烃的碳数乘以100。保留指数仅与固定相的性质、柱

56、温有关，与其它实验条件无。保留指数仅与固定相的性质、柱温有关，与其它实验条件无关。其准确度和重现性都很好。关。其准确度和重现性都很好。( (二二) )定量分析定量分析 定量分析的任务是求出混合样品中各组分的百分含量。色谱定量定量分析的任务是求出混合样品中各组分的百分含量。色谱定量的依据是，当操作条件一致时，被测组分的质量（或浓度）与检测器给的依据是，当操作条件一致时，被测组分的质量（或浓度）与检测器给出的响应信号成正比。即：出的响应信号成正比。即： i = fi Ai 式中式中i为为被测组分被测组分i的质量的质量； Ai为被测组分为被测组分i的的峰面积峰面积； fi为被测组为被测组分分i的的校

57、正因子校正因子。 可见，进行色谱定量分析时需要：可见，进行色谱定量分析时需要：（1）准确测量检测器的响应信号）准确测量检测器的响应信号 峰面积或峰高；峰面积或峰高；（2）准确求得比例常数）准确求得比例常数 校正因子；校正因子；（3）正确选择合适的定量计算方法，将测得的峰面积或）正确选择合适的定量计算方法，将测得的峰面积或 峰高换算为组峰高换算为组分的百分含量。分的百分含量。 （1）对称形峰面积的测量）对称形峰面积的测量 峰高乘以半峰宽法峰高乘以半峰宽法 对称峰的面积对称峰的面积 A = 1.065 h W1/2（2）不）不对称形峰面积的测量对称形峰面积的测量 峰高乘平均峰宽法峰高乘平均峰宽法

58、对于不对称峰的测量如仍用峰高乘以半峰宽，误差就较大，因此采对于不对称峰的测量如仍用峰高乘以半峰宽，误差就较大，因此采用峰高乘平均峰宽法。用峰高乘平均峰宽法。A = 1/2 h（W0.15 + W0.85） 式中式中W0.15 和和 W0.85分别为峰高分别为峰高0.15倍和倍和0.85倍处的峰宽。倍处的峰宽。1. 峰面积测量方法峰面积测量方法 峰面积是色谱图提供的基本定量数据，峰面积测量的准确与否直接峰面积是色谱图提供的基本定量数据，峰面积测量的准确与否直接影响定量结果。对于不同峰形的色谱峰采用不同的测量方法。影响定量结果。对于不同峰形的色谱峰采用不同的测量方法。2. 定量校正因子定量校正因子

59、 色谱定量分析的依据是被测组分的量与其峰面积成正比。但是峰面积的大色谱定量分析的依据是被测组分的量与其峰面积成正比。但是峰面积的大小不仅取决于组分的质量，而且还与它的性质有关。即当两个质量相同的不同小不仅取决于组分的质量，而且还与它的性质有关。即当两个质量相同的不同组分在相同条件下使用同一检测器进行测定时，所得的峰面积却不相同。因此，组分在相同条件下使用同一检测器进行测定时，所得的峰面积却不相同。因此，混合物中某一组分的百分含量并不等于该组分的峰面积在各组分峰面积总和中混合物中某一组分的百分含量并不等于该组分的峰面积在各组分峰面积总和中所占的百分率。所占的百分率。这样，就不能直接利用峰面积计算

60、物质的含量。为了使峰面积这样，就不能直接利用峰面积计算物质的含量。为了使峰面积能真实反映出物质的质量，就要对峰面积进行校正，即在定量计算是引入校正能真实反映出物质的质量，就要对峰面积进行校正，即在定量计算是引入校正因子。因子。 校正因子分为校正因子分为绝对校正因子绝对校正因子和和相对校正因子相对校正因子。fi = mi / Ai 式中式中fi值与组分值与组分i质量绝对值成正比，所以称为质量绝对值成正比，所以称为绝对校正因子绝对校正因子。在定量分析。在定量分析时要精确求出时要精确求出fi值是比较困难的。一方面由于精确测量绝对进样量困难；另一值是比较困难的。一方面由于精确测量绝对进样量困难；另一方面峰面积