细胞工程-动物细胞融合与单克隆抗体

1、动物细胞融合与单克隆抗体动物细胞融合与单克隆抗体第一节第一节 动物细胞融合动物细胞融合一、一、动物单个细胞的获得动物单个细胞的获得 动物细胞虽然没有细胞壁，但细胞间的连接方式多样而复杂，在进行有效的细胞融合之前，也必需获得单个分散的细胞获得单个分散的细胞。 组织的获得 采用各种适宜的方法处死动物，取出组织块放入小烧杯中，用剪刀将组织块剪刀将组织块剪碎成剪碎成1mm1mm3 3大小大小，用吸管吸取Hanks溶液冲下剪刀上的碎块，补加35ml的Hanks溶液，用吸管轻轻吸打，低速离心，弃去上清液，留下组织块。 组织的消化 通过生物化学的方法将剪碎的组织块分散成细胞团或单细胞。根据不同的组织对象采用

2、不同的酶消化液。如最常用的有最常用的有胰蛋白酶和胶原酶等胰蛋白酶和胶原酶等。其他的酶如链霉蛋白酶、粘蛋白酶、蜗牛酶等也可用于动物细胞的消化。EDTAEDTA最适合消化传代细胞，常与胰蛋白酶使用。 胶原酶消化 是一种由细菌中提取的酶，对胶原和细胞间质有较强的消化作用，适用于消化纤维组织纤维组织、上皮组织上皮组织、癌癌组织组织等。 （1）向培养瓶中放入15mm3大小的组织块，加5ml 2000单位/ml的胶原酶干液，最终浓度为200单位/ml，pH=6.5。 （2）36.5水浴448小时，无需摇动，中间可更换酶液一次。 （3）当组织变软，分散于瓶底时，轻轻震荡即散成细胞团或单个细轻轻震荡即散成细胞

3、团或单个细胞胞，小心倒出培养液。 （4）800r/min离心5分钟，弃上清液，重新悬浮BSS溶液中，再离心一次。 （5）加入培养液制成细胞悬浮液二、细胞融合的方法 细胞融合的方法包括:PEG法融合电融合病毒介导融合优点优点-成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。缺点缺点-过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，从而在原生质体之间形成分子桥，其结果是使原生质体发生粘连进而促使原生质体的融合； PEG能增加类脂膜的流动性，也使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能。操作步骤操作步骤 融合液：

4、融合液：CaCl22H2O 810mmol KH2PO4 0.7mmol 甘露醇或山梨醇 0.51.0mol pH 5.6 诱导液：诱导液：融合液PEG 2045 稀释液：稀释液：A液液（g/100ml）pH6.0 葡萄糖 7.21 CaCl22H2O 0.79DMSO 10ml B液液（g/100ml）pH10.5 甘氨酸 0.375 NaOH 0.169 首先，通过双向电泳使细胞间的接触变得首先，通过双向电泳使细胞间的接触变得非常紧密非常紧密( (高频交流电高频交流电) )。在活细胞等微粒的内部，诱导去极化，引起细胞聚集，排列成串珠状，互相紧密接触。 然后给予短暂的高压脉冲，引起细胞膜的然

5、后给予短暂的高压脉冲，引起细胞膜的穿透，随后细胞膜发生结合导致细胞融合。穿透，随后细胞膜发生结合导致细胞融合。为了稳定这个过程，在短期内需要施加交流电压。 电融合的优点 与PEG融合比较起来，电融合有三大优点：1、不存在对细胞的毒害问题；2、融合效率高；3、融合技术操作简便当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串；原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。电融合中的主要参数包括交流电压、交变电场的振幅频率、交变电场的处理

6、时间；直流高频电压、脉冲宽度、脉冲次数等。3.病毒介导的融合 略影响细胞融合的因素 首先，细胞的质量对细胞融合首先，细胞的质量对细胞融合起着至关重要的作用起着至关重要的作用，高质量的细胞是细胞融合的首要条件。 其次，融合方法其次，融合方法 其三，融合参数其三，融合参数，包括各种融合液都应选择适当。三、杂种细胞的筛选 原理：两种亲本细胞融合的混合物中可能有多种类型细胞，筛选的目的是获得优良的杂种细胞。 1）亲本 2）同核体：同源原生质体的融合体 3）异核体：非同源的原生质体的融合体 4）多核体：含有双亲不同比例核物质的融合体 5）异胞质体：具有不同胞质来源的杂合细胞。 6）核质体：有细胞核而带有

7、少量细胞质的亚原生质体 1）利用抗药性筛选系统：利用生物细胞对药物敏感性差异筛选杂种细胞。 亲本A：对氨苄青霉素敏感，对卡娜霉素不敏感 亲本B：对卡娜霉素敏感，对氨苄青霉素不敏感 杂种细胞可以在含有两种抗生素的培养基上生长 2）营养互补筛选系统：细胞在缺乏一种或几种营养成分时，不能生长繁殖，即营养缺陷型细胞。利用两种亲本细胞营养互补作用原理可以筛选杂种细胞。 亲本A：色氨酸缺陷型 亲本B：苏氨酸缺陷型 杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸的培养基上培养，而亲本细胞均会死亡。 3）温度敏感突变型杂种细胞的筛选：一般的培养细胞能在32度到40度的范围内生长，但温度敏感突变型的细胞能在高温或低温下生长。

8、由此筛选杂种细胞。 亲本一：具有卡那霉素抗性但只能在37度左右生长。 亲本二：高温敏感突变型，但不能抗卡娜霉素。 杂种细胞能在高温和含卡娜霉素的培养基上生长。第二节第二节 进入动物体内对肌体的免疫系统产生刺激作进入动物体内对肌体的免疫系统产生刺激作用的外源物质。用的外源物质。包括：蛋白质、多糖、核酸、病毒、细菌、各种细胞包括：蛋白质、多糖、核酸、病毒、细菌、各种细胞等。等。特点：外源性、结构性（分子表面具有稳定的环状结特点：外源性、结构性（分子表面具有稳定的环状结构基团作为识别位点）、特异性（抗原与抗体的反构基团作为识别位点）、特异性（抗原与抗体的反应）。应）。2抗体动物免疫系统分泌的中和或消

9、除抗原物质的影响的糖蛋白，存在于血清中，本质是免疫球蛋白（Immuniglobulin,Ig）。动物脾脏有上百万个动物脾脏有上百万个B B淋巴细胞淋巴细胞，一个细胞就是一个克隆，它一个细胞就是一个克隆，它针对针对抗原上的一个抗原决定簇产生的抗原上的一个抗原决定簇产生的抗体是单克隆抗体抗体是单克隆抗体。一种抗原通常具有多个不同的抗一种抗原通常具有多个不同的抗原决定簇，因此能刺激多个原决定簇，因此能刺激多个B B淋淋巴细胞产生相应的单克隆抗体巴细胞产生相应的单克隆抗体，因此血清中的抗体是针对不同抗因此血清中的抗体是针对不同抗原决定族的单克隆抗体混合物，原决定族的单克隆抗体混合物，称为多克隆抗体。称

10、为多克隆抗体。人体内的五种抗体二、单克隆抗体的制备二、单克隆抗体的制备 动物免疫与亲本细胞动物免疫与亲本细胞的选择的选择 细胞融合：淋巴细胞细胞融合：淋巴细胞杂交瘤的制备杂交瘤的制备 杂交瘤细胞的筛选：杂交瘤细胞的筛选：有限稀释法等有限稀释法等 单克隆抗体的制备和单克隆抗体的制备和冻存冻存 单克隆抗体的纯化单克隆抗体的纯化 骨髓瘤细胞：一般不分泌抗体，能在体外无限繁殖和连续继代培养，且为HPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）或TK（胸腺嘧啶核苷激酶） 。多用BALB/C 小鼠的骨髓瘤细胞。 淋巴细胞：经过免疫处理的淋巴细胞，多用大鼠或小鼠。 免疫方法：体内法或体外法。 体内法：对细胞或微生物

11、抗原可直接注射如小鼠体内，可溶性蛋白抗原可与等量的福氏完全佐剂混合乳化后，注入到动物体内。34天后，在无菌条件下可以取出脾或淋巴结制成悬液，存活率在95以上的可以用于融合。 体外法：直接提取大、小鼠淋巴细胞，调整为107个/ml，加适当浓度抗原，34天后，收集被刺激的淋巴细胞。 细胞融合 将免疫脾细胞和小鼠骨髓细胞以2：1或10：1的比例混匀于50ml锥形离心管内，1200rpm离心710分钟，尽量吸净上清液，用手指轻击管壁，使管底沉淀的细胞铺展成薄层，在室温条件下边轻轻振摇离心管边在60秒钟内逐滴加入50%的PEG 0.5ml，随后静置90秒，再于5分钟内边振摇边逐滴加入510ml不含血清的

12、培液或盐水缓冲液，以终止PEG的作用，再静置10分钟。HAT培养基筛选杂交瘤细胞 细胞团块分散后，加HAT溶液，稀释至骨髓瘤细胞不超过2105 ml，即可加入有饲养细胞的96孔塑料培养板内每孔0.1ml，如是24孔板，每孔0.5ml；总量分别为0.2ml和1ml。 用HAT选择性培养时每隔23天半量换液，7天后可以选择出杂交瘤细胞。细胞融合的选择示意图HAT选择系统 HAT是含一定浓度次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）及胸腺嘧啶核苷（T）的一种选择性培养基，其中三种成分与细胞DNA合成有关。 DNA合成途径有两种。 杂交瘤技术中，常选用次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷（HPRT-）骨髓瘤细胞或胸腺

13、嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）骨髓瘤细胞为亲本之一。 HPRT-细胞的嘌呤只能由全合成途径产生； TK- 细胞的嘧啶只能由全合成途径合成。 含氨基喋呤培养基抑制了细胞内嘌呤和嘧啶的全合成途径。 淋巴细胞具有合成淋巴细胞具有合成DNADNA的两条途的两条途径。径。 杂种细胞通过互补作用获得杂种细胞通过互补作用获得HRPTHRPT或或TKTK基因，可应用培养基中次黄基因，可应用培养基中次黄嘌呤及胸腺嘧啶核苷，通过嘌呤及胸腺嘧啶核苷，通过补救补救合成途径合成途径合成合成DNADNA。 在在HATHAT培养基中，培养基中，HPRTHPRT- - 或或TKTK- - 亲本细胞死亡，淋巴细胞亦逐渐亲本细胞死

14、亡，淋巴细胞亦逐渐死亡，只有死亡，只有杂种细胞存活杂种细胞存活。特异性杂交瘤细胞的筛选 通过选择性培养后生长的杂交瘤细胞，仅有部分是分泌预定特异性抗体的杂交瘤细胞。可取上清液，根据抗原的性质、抗体类型及所需灵敏度等具体情况来加以选择。 可溶性抗原可采用放射免疫、免疫酶 标测定、间接血凝等方法测定。细胞 抗原可采用免疫荧光、51Cr释放试验、 溶血空斑测定、补体依赖的细胞毒等 方法直接测定针对这些抗原的抗体。利用培养基对单抗进行鉴定的过程 利用单个细胞培养技术选育出遗传稳定的分泌特异抗体的细胞系。 在培养过程中，一般要加能释放某些生长因子促进杂交瘤生长的饲养细胞，如小鼠的腹腔巨噬细胞、脾细胞 或

15、胸腺细胞等。 方法有有限稀释法、软琼脂培 养法、显微操作法、应用荧光 激活分选仪等。 通过适当的稀释达到分离单个细胞进行培养的目的 1）取出阳性孔内的细胞进行计数 2）用培液将其稀释到例如每毫升内10个细胞。 3）如果在96孔板内每孔加0.1ml， 其机率将为每孔内落入一个细胞。 4）加入一定数量的饲养细胞， 经过812天后，可观察到有集落生长的孔。 5）根据检测的阳性结果再次进行克隆化。 在加入饲养细胞的无菌平皿内铺上一层0.5的琼脂，待凝固后再铺上一层混有杂交瘤细胞的0.25的软琼脂。待细胞长成集落后，用毛细管吸出移种于含饲养细胞的96孔板内。 1）诱生腹水 将稳定分泌单抗的细胞株，通过扩

16、大培养，接种于Balb/c小鼠腹腔内，使其以腹水瘤形式在小鼠腹腔内增殖，从而得到大量含单抗的腹水。 方法是将降植烷或石蜡油注入Balb/c小鼠腹腔，0.5ml/只，7天后腹腔接种35106 杂交瘤细胞。1020天后即可抽取腹水，每毫升腹水中约含110mg单抗。 2）利用微载体、微囊、旋转瓶、中空纤维培养系统等进行大规模培养。 3）生物反应器培养杂交瘤细胞大规模生产单抗 单抗作为体内体外诊断试剂在临床生化诊断、病理组织定位、体内肿瘤的定位等 单克隆抗体靶向制剂：治疗癌症等疾病 杂交人鼠单克隆抗体 现在已经有各种不同类型的单抗试剂合在市场出售，例如乙型肝炎的表面抗原，铁蛋白、促绒毛膜性激素、促甲状

17、腺激素、癌症、艾滋病等诊断试剂。 用同位素标记的单抗在特定的组织中 成象的技术可以用于肿瘤、心血管畸 形的体内诊断。 1）药物与单抗直接偶联 通过化学反应使药物分子的氨基与抗体分子的羧基之间直接形成稳定的酰胺键。 利用氧化剂把药物分子上的糖基氧化成羰基。 利用羰基与抗体分子的氨基反应形成西佛氏碱，最后还原。 这样的靶向制剂保留一定的药物活性， 并具有一定的选择性。 如：1，4溴柔红霉素与肿瘤细胞单抗 形成的偶合物，对肿瘤有明显的选择性 毒性。 2）药物通过小分子与单抗连接 通过一些小分子交联剂，把药物分子上的某些基团连接起来。 小分子交联剂：如同型双功能试剂，包括戊二醛、顺乌头酸酐、马来酸酐、

18、戊二酐；异型双功能试剂：N琥珀酰胺基3丙酸和寡肽等。 顺乌头酸酐制成的最常用，在中性 条件下较稳定，在酸性条件下容易 发生水解。这种靶向试剂与肿瘤的 表面抗原结合后，会进入溶酶体， 在酸性环境下释放药物，而杀死 肿瘤细胞。 3）药物通过大分子与抗体相连 大分子聚合物：葡聚糖、多聚赖氨酸、多聚谷氨酸、聚合多肽和血清蛋白等。 总之，利用单抗试剂合可以作为靶向药物，针对肿瘤、自身免疫系统疾病、各种病原体病等。3、杂交人鼠单克隆抗体 鼠源抗体一般无法有效地激发宿主的免疫防卫系统，还可能引发人对鼠源抗体本身的免疫反应。 在抗体中，Fc片段在抗体中的作用是激活机体免疫反应。 对鼠源抗体进行改造，利用人源的Fc区域的DNA片段替换鼠源单抗的Fc的DNA片段。 嵌合抗体可以保留其目标专一性，降低人的抗鼠反应。 方法1：分离人B细胞，使之与荧光标记的抗原相结合，通过荧光标记选择能产生特殊抗体的B细胞，并用EpsteinBarr病毒转化，得到少量的单