妊娠晚期抗病毒免疫阻断治疗对新生儿血清HBV转录体的影响

1、    妊娠晚期抗病毒免疫阻断治疗对新生儿血清HBV转录体的影响            作者：时间：2007-11-22 11:33:00                          

2、         作者：李艳红，张伟，朱少君，崔云，郭永，王清图，苏勤，冯英明 【关键词】  宫内感染    Influence on serum hepatitis B virus transcripts in newborns by HBIG immunoblocking therapy during the later stage of pregnancy【Abstract】 AIM: To investigate the significance of vi

3、ral transcripts in earlystage diagnosis of HBV vertical transmission, and to observe the influence of HBIG immunoblocking therapy on serum HBV RNA in newborns from HBV carrier mothers. METHODS: Fortysix HBsAg positive pregnant women were treated with antiHBV immunotherapy (HBIG 200 IU/4 weeks and Li

4、midazole was applied as liniment 10 mg/week) since 26week pregnancy. The other 23 were taken as controls without any antiHBV therapy. Viral nucleic acids were extracted from sera of mothers before therapy and from sera of newborns. HBV DNA and RNAs, including the fulllength and truncated RNA molecul

5、es, were amplified respectively through PCR and RTPCR targeted to the HBV X proteinencoding region. RESULTS: Serum HBV DNA in newborns was only found when their mothers had not been treated. Circulating viral RNA was detected in more than half of the newborns irrespective of treatment of mothers. Ho

6、wever, in the newborns of treated mothers, serum RNA was uniformly of the truncated type. CONCLUSION: Application of serum HBV RNA is greatly helpful to the diagnosis of earlystage infection of newborns from HBV carrier mothers. Truncated RNA is transcribed from HBV templates in the newborns rather

7、than being transmitted from mother to child, immunoblocking therapy does not interfere with intrauterine infection. However, it may interfere with the manifestion of a high replicative infection.【Keywords】 hepatitis B virus; transcript; vertical transmission; intrauterine infection; immunotherapy【摘要

8、】 目的：探讨乙型肝炎病毒（HBV）转录体在早期诊断HBV母婴传播中的意义， 并观察母亲抗乙型肝炎病毒免疫球蛋白（HBIG）免疫阻断治疗对新生儿血清HBV转录体的影响方法：治疗组46例HBV表面抗原（HBsAg）阳性孕妇自孕26 wk开始行抗HBV免疫治疗（HBIG im, 200 IU/4 wk; 同时使用左旋咪唑涂布剂10 mg/wk）；另23例HBsAg）阳性孕妇做为对照组未给予任何抗病毒治疗. 从孕妇治疗前血清及其新生儿血清中提取核酸，经PCR及RTPCR扩增HBV DNA，全长型RNA （fRNA）和顿挫型RNA（trRNA），琼脂糖凝胶电泳显示产物，Southern杂交进一步验证扩

9、增产物. 结果： HBV DNA阳性仅存在于未接受免疫治疗的母亲所生新生儿中； 超过半数的新生儿血清中可检测到病毒转录体RNA， 并与其母亲是否接受免疫阻断治疗无关. 但是，治疗组母亲所生新生儿中仅可检测到顿挫型病毒转录体trRNA. 结论： 血清HBV转录体可早期诊断新生儿HBV感染的状态； 新生儿血清中trRNA的转录模板可能为新生儿体内的病毒DNA; HBIG免疫阻断治疗不能阻断HBV宫内感染，但可以阻止高复制性感染的发生.【关键词】 乙型肝炎病毒；转录体；母婴传播；宫内感染；免疫疗法0引言母婴传播是形成慢性HBV感染的重要原因. 据估计我国的慢性HBV感染约有30%50%是通过母婴传播

10、发生的. 对于未接受治疗的母亲来讲单独HBsAg阳性母亲的婴儿，约40%在半岁内出现HBsAg阳性的所谓“突破性感染”1-3. 而HBsAg和HBeAg双阳性母亲的婴儿HBsAg阳性率高达90%以上4.  这些婴儿多数转变为慢性HBV感染形成新的传染源，并成为发生肝细胞癌（HCC）的高危人群. 由于大部分受感染的新生儿延迟出现诊断性的指标HBsAg和HBV DNA, 再加上部分病毒抗原和抗体可以通过胎盘屏障进入胎儿体内，使得新生儿感染的早期诊断显得极为复杂和困难1,5. 有研究表明，新生儿延迟出现的“突破性感染”发生在已有的隐匿型感染的基础上1,6-7. 我们的研究表明，结合病毒转录

11、体的检测可以更精确地诊断和区分复制期和非复制期（既隐匿型感染）等不同的感染阶段8-11. 并且，我们前期的研究也显示，在慢性HBV感染母亲所生的新生儿中，HBV转录体是一个较早出现的病毒标志物12. 本研究拟应用我们建立的血清HBV RNA检测方法，进一步分析血清病毒转录体在早期诊断新生儿感染状态中的意义，以及免疫治疗对它的影响.1材料和方法1.1材料1.1.1病例选择69例HBsAg阳性孕妇分为治疗组46例及未治疗组23例. 69例孕妇孕期均无先兆流产史无急性或慢性肝炎病史症状及体征无肝功能受损情况.  孕妇年龄孕产次胎龄均无明显差异. 69例孕妇分娩新生儿69(男36，女33)例

12、.1.1.2试剂高纯度核酸提取试剂盒、核糖体RNA (rRNA)、单管RT/PCR试剂盒、地高辛探针标记及原位杂交试剂盒均购自Roche公司(Mannheim, 德国)，原位杂交试剂盒、DNase和RNase灭活的吸头购自Biolabs，HybondN+尼龙膜购自Amersham， Taq DNA聚合酶、100 bp DNA Marker及DNase I均为Gibcol产品，DNase和RNase灭活的试管和离心管购自Eppendof公司. 其他常用试剂和药品均为分析纯或电泳级.1.1.3引物和质粒PCR引物由上海生工合成. 用于阳性对照的质粒为40A和41A13， 均由德国癌症研究中心病毒与

13、宿主相互关系分部制备.1.2方法1.2.169例HBsAg阳性孕妇治疗方法孕26 wk开始，按来诊次序分为治疗组46例，孕26 wk始孕妇臀大肌注射已型肝炎病毒免疫球蛋白（HBIG ）（上海生物制品研究所生产批号为20000712) 200 IU/4 wk， 同时使用左旋咪唑涂布剂(福建省凯华药业有限公司生产批号为20000307 500 mg/支) 5 mL涂布于上下肢体内侧皮肤易吸收处2次/wk，3 mo一疗程. 未治疗组23例根据患者或其亲属的意见未给予上述任何主动或被动免疫防治措施，孕妇所生的新生儿的乙肝疫苗接种均按第0,1,6月进行.1.2.2血清分离和核酸提取孕妇26 wk肘静脉采

14、血2 mL，新生儿分娩后24 h内采股静脉血2 mL. 按照我们建立的方法10，于30 min内应用低温离心（4000 r/min，20 min，4）分离血清. 核酸的提取采用高纯度病毒核酸提取试剂盒，按照说明书操作，仅将其中的poly(A) RNA替换为rRNA作为载体RNA，以免与后面使用的oligod(T)引物结合而干扰HBV 3端的结构分析. 200 L血清标本提取后可得到50 L的核酸提取物.1.2.3目的核酸扩增按我们建立的方法10，针对HBV基因X区血清核酸的PCR，RTPCR所用上游引物包括txs（1445）：5GGACCGTGTGCACTTCGCTT3，txs1（1454）：5GCACTTCGCTTCACCTCTGC3，txs2（1464）：5TCACCTCTGCACGTCGCATG3；下游引物包括：txas（1574）：5CCTCAAGGTCGGTCGTTGAC3，xas1（1668）：5AATTTATGCCTACAGCCTCC3， txas5（1683a）：5(T)15 GCTGG3. 扩增病毒DNA采用50 L反应体系，Tag DNA聚合酶5 U，引物为txs/