壳聚糖制备工艺改

1、实验一：壳聚糖制备工艺一、实验目的1、了解制备甲壳质和壳聚糖的意义；2、学习甲壳质和壳聚糖制备工艺。二、实验原理壳聚糖是碱性多糖，有止酸、消炎作用，可抑制胃溃疡。动物实验表明，可降低胆固醇、血脂。国外已报道用作心血管系统降低胆固醇的药物。经分子修饰制得的肝素类似物，具有抗血栓作用，能与肝素妣美。壳聚糖广泛用于食品与医药，如用作药物的载体具有缓释、持效的优点；用于制作人造皮肤、人造血管、人工肾、手术缝合线等。虾蟹壳含无机盐碳酸钙和磷酸盐约占45%；蛋白和脂肪约占27%；甲壳质约占20-25%（蟹壳含甲壳质17.1-18.2%;龙虾含甲壳质22.5%;虾壳含甲壳质20-25%）甲壳质是聚-2-乙酰

2、氨基-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖，以-（1，4）糖苷键连接而成，是一种线型高分子多糖，天然的中性粘多糖。甲壳质一般与蛋白质或碳酸钙或两者紧密结合在一起。盐酸浸泡处理可除掉壳里的无机盐碳酸钙、磷酸盐，壳中的 CaCO3与HCL生成CaCL存在于废酸液中被除掉。碱处理可除掉壳中的蛋白和脂肪。经分离制得的甲壳质为白色无定型粉末，或亮白色半透明的小片状物。甲壳质不溶于水、稀酸、碱溶液和乙醇、乙醚等有机溶剂，溶于无水甲酸、浓无机酸。浓热碱液与甲壳质作用，可脱掉甲壳质分子结构上的乙酰基，生成壳聚糖。即壳聚糖是由甲壳质在高浓度碱液中脱乙酰制备而成。壳聚糖为可溶性甲壳质，化学名称为聚-2-氨基-2-脱氧-D-吡

3、喃葡萄糖，以-（1，4）糖苷键连接而成。相对分子量约为12万-59万，是一种大分子阳离子聚合物。壳聚糖不溶于水和一般有机溶剂，不溶于碱，可溶于酸性水溶液（但不溶于硫酸）。制备高黏度（高分子量）壳聚糖，脱乙酰工艺路线有几条，学生自行设计：1.60-70，40-41%NaOH溶液保温20h；2.110-120，45-50% NaOH溶液反应1h左右；3.间歇式工艺路线：100条件下，45%的NaOH 溶液，1+1间歇反应2次，每次反应1h，每次反应后水洗至中性。三、实验材料1.材料与试剂虾壳，1mol/L盐酸，5%氢氧化钠，95%乙醇，乙醚，硼氢化钠 2.仪器与设备粉碎机，20目筛，方盘，磁力搅拌

4、器，电磁炉，恒温水浴锅，真空干燥箱，布氏漏斗，抽滤瓶，循环水泵，三口烧瓶，冷凝管，温度计，烧杯，量筒，pH试纸，滤纸，纱布。四、实验步骤 虾壳（称重，取25g），加1mol/L盐酸溶液，（固液比1:10，搅拌，静置12h） 过滤。加 5% 氢氧化钠溶液，（固液比1:8），搅拌,隔水煮1h，过滤，得甲壳质，烘干，粉碎，待用。取5g甲壳质于三口瓶中，加45%氢氧化钠溶液（固液比1:20），再加1% 硼氢化钠，于110-120 搅拌反应1h，冷却，离心，移去上清液，水洗沉淀，再离心，再移去上清液，水洗沉淀，再移去上清液，以95%乙醇洗涤沉淀，一起倒入抽滤瓶中，抽滤，留滤饼，得壳聚糖，晾干，称重。五、

5、实验结果1.测定产品的主要质量指标黏度和脱乙酰度；2.每种指标有两种测定方法，学生可以自选，测定方法见实验讲义附件。六、思考题1由甲壳质制备壳聚糖为什么要加入硼氢化钠？2如何评价壳聚糖的质量？七、参考书目李良铸、李明晔编最新生化药物制备技术中国医药科技出版社，2001.3附：壳聚糖脱乙酰度测定方法壳聚糖的脱乙酰度，也就是壳聚糖分子链上自由氨基的含量，是一项极为重要的技术指标之一。壳聚糖脱乙酰度的高低，直接关系到它在稀酸中的溶解能力、黏度、离子交换能力、絮凝性能和氨基有关的化学反应能力，以及许多方面的应用。壳聚糖的脱乙酰度可定义为壳聚糖分子中脱除乙酰基的糖残基数占壳聚糖分子中总的糖残基数的百分数

6、。测定脱乙酰度的方法有很多，如：红外光谱法、紫外光谱法、滴定法等。方法一：紫外光谱法仪器：紫外-可见分光光度计、 紫外皿4个、精密pH计1台 100mL容量瓶3个、电子天平1台、架1个、10mL试管15支500mL烧杯1个、250mL烧杯1个、50mL烧杯1个 试剂：N-乙酰葡萄糖胺、去离子水、盐酸（分析纯）方法：以0.001mol/L HCl (分析纯 为溶剂，用0.1mg/mL N-乙酰葡萄糖胺标准品配成0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mg/mL 的标准溶液。以0.001mol/L HCl为参比液，在199nm处测定系列溶液的吸光度，最大吸光度A与浓度C的关系为A=17C.

7、称1020mg壳聚糖样品于100mL容量瓶中，加入10mL 0.01mol/L盐酸，全部溶解后，用去离子水稀释至刻度、摇匀。以0.001mol/L盐酸作参比液，测量其在199nm时的吸光度，制作工作曲线，从工作曲线中得到样品中N-乙酰葡萄糖胺的浓度，从而求得脱乙酰度（%）=100%-（样品中乙酰基浓度/标准品浓度）×100%。方法二：酸碱滴定法酸碱滴定法，不需要特殊的仪器，重复性较好，特别适合于生产过程中的质量监控。仪器：碱式滴定管2个、500mL烧杯1个、250mL烧杯2个50mL烧杯1个、吸管2个、滴定台1个250mL三角瓶9个、精密pH计1台、100mL容量瓶3个电子天平1台、

8、试管架1台、10mL试管10支 试剂：N-乙酰葡萄糖胺，凡士林，去离子水，盐酸（分析纯），甲基橙指示剂，氢氧化钠滴定液（0.1mol/L），盐酸滴定液(0.1mol/L。实验原理：壳聚糖的自由氨基呈碱性，可与酸定量地发生质子化反应，形成壳聚糖的胶体溶液，溶液中游离的H+用碱反滴定，这样，从用于溶解壳聚糖的酸量与滴定用去的碱量之差，即可推算出壳聚糖自由氨基结合酸的量，从而计算出壳聚糖分子中自由氨基的含量。实验前准备：用1mol/L的盐酸标定NaOH，得CNaOH=0.1047mol/L根据药典的规定配制甲基橙指示剂；实验步骤：准确称取0.30.5克壳聚糖样品，置于250mL三角瓶中，加入标准0.

9、1mol/L盐酸溶液30mL，在2025搅拌至溶解完全（可加适量的蒸馏水稀释），加入23滴指示剂，用标准0.1047mol/L的NaOH溶液滴定游离的盐酸。另取一份样品，置于105烘干至衡重，测定水分。每个样品要各测3次。计算：DD(C1V1-C2V2×0.016/G(100-W×0.0994×100其中：C1盐酸标准溶液的浓度，mol/LC2氢氧化钠标准溶液的浓度,mol/LV1加入的盐酸标准溶液的体积，mLV2滴定耗用的氢氧化钠标准溶液的体积，mLG样品重，gW样品的水分，；0.016与1mL，1mol/L盐酸溶液相当的氨基量，g。注意事项：在室温下溶解样品；

10、样品必须是中性的；样品必须是中性的，否则会影响测定结果。附：壳聚糖粘度与粘均分子量测定方法黏度反映了高分子物的分子量大小。壳聚糖是一种天然高分子多糖，分子量大小不同，其物理机械性能也不一样，用途也不同，因此黏度是其一项重要指标。黏度的测定方法有多种，其物理意义不一样。在壳聚糖的生产上，常用旋转黏度计和乌氏黏度计来测定壳聚糖的黏度。测定方法不同，物理意义不一样。方法一：乌式粘度稀释法乌氏黏度计的原理是在一定温度和溶剂条件下，特性黏度和高聚物摩尔质量M之间的关系通常 用带有两个参数的Mark-Houwink经验方程式来表示：=KM式中，M为黏均摩尔质量；K为比例常数；是与分子形状有关的经验参数。K

11、和值与温度、聚合物、溶剂性质有关，也和分子量大小有关。K值受温度的影响较明显，而值主要取决于高分子线团在某温度下，某溶剂中舒展的程度，其数介于0.51之间。K与的数值可通过绝对方法确定，有下列公式可求 y= =式中，t为测定溶液黏度时液面从a刻度流至b刻度的时间；t0为纯溶剂流过的时间，c为壳聚糖溶液的浓度，可以看出高聚物摩尔质量的测定最后归结为特性黏度的测定。本实验采用毛细管法测定黏度，通过测定一定体积的液体流经一定长度和半径的毛细管所需时间而获得。仪器：乌式粘度计、秒表1块、100mL量瓶3个、恒温水浴锅1个电子天平1台、移液管2mL 3支、1mL 2支、吸嘴2个大烧杯2个、量筒100mL

12、、量筒10mL试剂：N-乙酰葡萄糖胺、去离子水、盐酸（分析纯）、氯化钠混合溶剂（醋酸0.1mol/L，氯化钠0.2mol/L）方法：1.仪器：乌氏黏度计、恒温水浴一套、秒表、温度计：分度为0.1，用于测水 浴温度。 2.实验前准备：黏度计的洗涤，先用热洗液(经砂心漏斗过滤将黏度计浸泡再用 自来水、蒸馏水分别冲洗几次，每次都要注意反复流洗毛细管部分，洗好后烘干备用；调节恒温槽温度至(25.0±0.1；3.操作步骤：把壳聚糖样品干燥衡重，精确称取11.2g(称量精度0.005g，用0.1mol/L乙酸-0.2mol/L氯化钠溶剂配成50mL样品溶液，此样品溶液的浓度为C1，此溶液经过过滤

13、，精密量取中间部分滤液10mL，移入乌氏黏度计测管（粗管），将黏度计垂直固定于衡温水浴中保温达10分以上，使管内溶液的温度与水浴温度达到平衡。在另外2根支管口各接1根乳胶管，将侧管上面的乳胶管用夹子夹住，在B管处用洗耳球将溶液从F球经D球、毛细管、E球抽至G球2/3处，松开食指，让C管通大气，此时D球内的溶液即回入F球，使毛细管以上的液体悬空。毛细管以上的液体下落，当液面流经a刻度时，立即按停表开始记时间，当液面降至b刻度时，再按停表，测得刻度a、b之间的液体流经毛细管所需时间。重复这一操作至少三次，它们间相差不大于0.3s，取三次的平均值为t1。4.溶剂流出时间的测定：先用壳聚糖溶液的溶剂润

14、洗黏度计几次，步骤如上, 实验完毕后，黏度计一定要用蒸馏水洗干净。计算产品粘均分子量精密称取壳聚糖0.3g，置100mL量瓶中，加入混合溶剂（醋酸0.1mol/L，氯化钠0.2mol/L）80mL，加热使溶解，放冷，加混合溶剂至刻度。按药典法测定特征性粘度【】，按公式：【】=1.81×10-3M0.93计算平均得：M=log0.93/1.81×10-3 壳聚糖的粘度与分子量相关，分子量越大，粘度越大。粘度与壳聚糖药剂学上的某些应用（如膜剂）相关，故设立此项。用乌氏粘度计稀释法测定。具体计算为：【】=【ln（T/To）】/CT：供试液流出时间；To：溶剂流出世间；C：供试液浓

15、度（g/mL）。【】代入公式计算。因药典要求T在120180s之间，参照一般报道分子量设定=1×106设T=150s【2】，实验测得To=20s，计算得C=0.3%，初配壳聚糖醋酸液的浓度为0.3%，具体浓度应视T值实际情况相应调整。判断标准（高粘度壳聚糖：1%壳聚糖溶于1%醋酸溶液中，粘度大于1000mPa.s ；中等粘度壳聚糖：1%壳聚糖溶于1%醋酸溶液中，粘度为100500mPa.s ；低粘度壳聚糖：2%壳聚糖溶于2%醋酸溶液中，粘度为2550mPa.s）方法二：NDJ-5S数字式粘度计法NDJ-5S数字式粘度计法使用说明NDJ- 系列粘度计是采用高细分驱动步进电机、16 位微

16、电脑处理器和带夜视功能液晶屏的数字显示式粘度计。该仪器转速平稳、精确，按键标示明确，程序化设计，操作简便，屏幕直接显示粘度、转速、百分计标度、转子号以及所选用转子在当前转速下可测的最大粘度值。主控板、细分驱动板全部采用贴片技术，电路设计采用目前最先进微电脑处理器，结构布局合理紧凑。提供 RS232 接口，打印间隔可由用户自行设置。该仪器满量程、各档线性度全部通过 PC 接口进行计量校正，其性能、功能达到国外同类型先进水平。 SNB- 系列 粘度计是 基 于 NDJ- 系列粘度计的升级产品。除具备 NDJ- 系列粘度计的性能、特点外， SNB- 系列 粘度计的 测量范围更广，转速选择改进为全程无

17、级变速，并可通过 PC 接口进行全自动化数据采集，以及连接电脑完成自动化操作、数据保存及历史数据对比等多项数理统计分析任务。NDJ- 系列、 SNB- 系列粘度计用于测量液体的粘性阻力与液体的动力粘度。广泛应用于测定油脂、油漆、食品、涂料、造纸、化妆品、化工、胶囊胶粘剂及药物等各种流体的粘度。 1 主要技术规格 型 号 NDJ-5S NDJ-8S SNB-1 SNB-2 测量范围（mPa·s）(毫帕·秒 1100,000 12,000,000 1600,000 16,000,000 旋转速度 (RPM ( 转/ 分钟 6, 12, 30, 60 0.3, 0.6, 1.5,

18、3, 6, 12, 30, 60 160(无级变速 0.199.9（无级变速） 转子数量 随机配置 1, 2, 3, 4 号 4 种转子 0 号转子为选配件 测量精度 ± 2.0% 重 现 性 0.5% 电 源 电源适配器 ( 输入 220 V 50 ± 1Hz, 输出 15V 1.2A 2 结构原理如图所示， 以高细分驱动步进电机带动传感器指针，通过游丝和转轴带动转子旋转。如果转子未受到液体的阻力，游丝传感器指针与步进电机的传感器指针在同一位置。反之，如果转子受到液体的粘滞阻力，游丝产生 扭矩与 粘滞阻力抗衡，最后达到平衡。这时分别通过光电传感器输出信号给 16 位微电脑

19、处理器进行数据处理，最后在带夜视功能液晶屏幕上显示液体的粘度值（mPa·s）。3 . 仪器配置 （1）数字式粘度计1台（2）升降架：1套（3）转子保护框架1只 （4）电源适配器1只（5）转子（1,2,3,4号各1支）（6）扳手1只（7）一字螺丝批1只（8）座脚1 套可选择配置件：（1）号转子(用于测定超低 粘度 （2） RTD 温度探针（3）能实行全自动化数据采集功能的专用软件（4）专用打印机（5）少量样品测定专用装置（6）遥控操作器4 . 安装（参照总装示意图后按下列步骤进行）(1 从包装箱中取出座脚、升降架、主机、转子架、保护框架等。 (2 将升降架装入座脚圆孔中，保持座脚开口方

20、向及升降架上齿条均面向操作者后，用扳手将螺母 M12 旋紧。(3 转动升降架上旋钮，检查升降夹头的灵活性和自锁性，发现过松成过紧现象可用螺丝刀调整升降架后部的 M4 螺钉，使之能上下升降，偏紧为宜，以防装上粘度计后产生自动坠落情况。 (4 把粘度计装到升降架上，用紧定螺钉拧紧。旋松仪器下方黄色盖帽上的螺钉并将该盖帽取下，放好备用。黄色盖帽起到保护连接螺杆的作用，长期不用或运输时，一定要将黄色盖帽盖上。(5 调节二个水平调节脚 , 直至粘度计顶部的水泡在中央位置。(6 如有RTD 温度探针，请安装到接口。有打印机，请安装到 RS232 接口。(7 确定粘度计的电源开关置于OFF 状态 , 接通电

21、源 。5 . 屏幕内容介绍开机或按复位 键后 画面先显示型号 SNB-1SNB-1 表示该仪器型号，等待大约 3 秒钟后显示如下： 20.0 60.0 RPM 45.7% 888888.8 SP 4 mPa·s 20.0 表示 RTD 温度探针测量到温度。 单位 。SP 4 表示 4 号转子，0 表示 0 号转子，1 表示 1 号转子，依此类推。60.0 RPM 表示 电机当前转速。单位 RPM 。888888.8 mPa · s 表示 所选用转子在当前转速下可测的最大粘度值。单位 mPa · s按测量 键后 显示的 888888.8 mPa · s 为

22、所选用转子在当前转速下测得的粘度值。45.7 % 表示百分计标度，也称扭矩。百分计标度在 10%-90% 之间为正常值。 若不在此范围内，粘度计会发出报警声，提示用户更改转速和转子。6 操作步骤（1）按照“ 4. 安装”步骤将粘度计安装到位。（2）将转子保护框架装在粘度计上，( 向右旋入装上 , 向左旋出卸下 。（3）将选用的转子旋入连接螺杆 ( 向左旋入装上 , 向右旋出卸下 （4）开机，步进电机开始工作。（5）输入选用转子号：每按转子键一次，屏幕显示的转子号相应改变，并在 1 2 3 4 0 之间循环，当屏幕显示为所选用的转子号时，即完成输入。（6）选择转速：每按转速键一次，屏幕显示的转速

23、相应改变，并在其技术规格所确定的转速范围内（如： 6.0 12.0 30.0 60.0 等）循环，当屏幕显示为所选用的转速时，即完成转速选择。用于SNB- 系列的选择转速：按转速键屏幕会出现60（或 60.0 ），并在“ 6 ” 字符上不断闪烁 , 这时可以通过按数字增加键或减少键来设置转速的十位数；然后通过 按向右移位键可逐位移向个位数及小数点后的十分位数，若需反向移位时， 则通过按向左移位键来完成；采用相同于上述十位数的设定方法可完成其他位的数值设定， 转速设定完毕后 , 按转速键确认 。（7）旋动升降架旋钮，使粘度计缓慢地下降，转子逐渐浸入被测液体当中，直至转子上的标记与液面相平为止。调

24、整粘度计位置至水平。（8）按测量键，即可同时测得当前转子、转速下的粘度值和百分计标度。（9）在测量过程中，如果需要更换转子，可直接按转子键，此时电机停止转动，而粘度计不断电。当转子更换完毕后，重复以上第（6）至（8）条即可继续进行测量。 (10 打印：a先选择打印时间间隔 : 按打印键，屏幕左下方出现 S：00：05，每按打印键一下屏幕显示的打印时间间隔参数相应改变，并循环出现 00：05 00：10 00：20 00：30 01： 00 01：30 02：00 05：00 ；S：00：05 表示每隔 5 秒打印一次，00：10 表示每隔 10 秒打印一次， 05：00 表示每隔 5 分钟打印

25、一次，依此类推；当屏幕显示为所选用的打印时间间隔时，即完成打印时间间隔的选择。 SNB 系列产品则需再按一次打印确认。b. 接上打印机，再按一次打印键，打印机会打印出 on，表示开始安打印时间间隔打印，再按一次打印键，打印机会打印出 off，表示打印结束。7 未知粘度范围样品测量（1） 测量一般原则：高粘度的样品选用小体积（3、4 号）转子和慢的转速，低粘度的样品选用大体积（1 、2 号）转子和快的转速。每次测量的百分计标度（扭矩）在 10 90 之间为正常值，在此范围内测得的粘度值为正确值。（2） 先大约估计被测样品的粘度范围，然后根据高粘度的样品选用小体积的转子和慢的转速，低粘度样品选用大体积的转子和快的转速。一般先选择转子，然后再选择合适转速。例如转子 SP 为 1 号时，转速为 60RPM ，屏幕直接显示满量程为 100mPa.s ，当转速改为 6RPM 时，满量程为 1000mPa.s 。（3） 当估计不出被测样品大致粘度时，应先设定为较高的粘度。试用从小体积到大体积的转子和由慢到快的转速。然后每一次测量根据百分计标度（扭矩）来判断转子和转速选择的合理性，百分计标度一定要在 10 90 之间为正常值，若不在此范围内，粘度计会发出报警声，提示用户更改转速和转子。千万别忘了换了转子一定要