粒体DNa片段诱导小鼠胚胎成纤维细胞恶性转化

1、    粒体DNa片段诱导小鼠胚胎成纤维细胞恶性转化            摘 要 目的：探讨线粒体DNA(mtDNA)片段的恶性转化效应和转化机制。方法：采用基因转入技术，观察经mtDNA片段转染后小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)在裸小鼠体内的成瘤能力，并对形成的肿瘤进行病理观察；同时应用荧光原位杂交(FISH)方法，观察mtDNA片段在NIH3T3细胞核内的整合情况。结果：转染后1周,18%20%的NIH3T3细胞核中发现有目的基

2、因探针的阳性杂交信号；转染后2周的培养细胞在裸小鼠皮下形成肿瘤的能力为100%(8/8)；且形成肿瘤的病理表现与纤维肉瘤的特征相一致。结论：mtDNA片段在核基因组中的自发整合是促发细胞癌变的又一因素。    关键词：DNA,线粒体 成纤维细胞 小鼠,裸 动物实验替代试验    目前，关于肿瘤病毒或活化癌基因能诱导良性细胞恶性转化的研究已非常普遍。但作为哺乳动物细胞唯一核外基因组的线粒体DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)，是否也具有类似于肿瘤病毒那样的活性尚缺乏有力的实验证据1，2。前期研究

3、发现，癌细胞核基因组中存在mtDNA的同源序列。这些同源序列的来源及其在细胞癌变中的作用也仅仅是理论上的推测。我们通过mtDNA片段向小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)进行基因转入的方法，探讨了mtDNA片段的恶性转化效应及转化机制。    材料与方法    1.主要试剂：PCR试剂盒,PCR产物纯化试剂盒,PCR地高辛(DIG)探针合成试剂盒，抗DIG荧光抗体均为德国宝灵曼公司产品。    2.实验动物： 选大小相近的BALB/C裸小鼠16只,体重13 g±5 g

4、，用于转化细胞体内接种实验。    3.受体细胞及细胞培养：选用NIH3T3(美国，NIH)为受体细胞。将3×105细胞接种于100 ml细胞培养方瓶中,加入含15%小牛血清的RPMI-1640培养基，于37 5% CO2孵箱中无菌培养，每3天传代1次。    4.目的mtDNA基因片段的PCR扩增与纯化： 引物1：5-ATCTTAATGGCACATGCAGC-3,引物2：3-TCTAATGTGTACGTTCGTTCGTAG-5, 扩增包含Co、tRNALys、ATPase 6共3个完整基因在内的1 62

5、6 bp mtDNA片段。用此片段作为转染目的基因片段。以人肺腺癌SPC-A-1细胞(取自中科院上海细胞所)mtDNA为模板，扩增的mtDNA基因片段，代表癌细胞来源的mtDNA片段；以1名无肿瘤及也无其他遗传病家族史的45岁健康男性外周血白细胞mtDNA为模板，扩增的mtDNA片段，代表正常细胞来源的mtDNA片段。mtDNA模板的制备及PCR扩增方法参见文献3，4。 PCR产物的纯化参照试剂盒说明书进行。    5.实验分组：组：NIH3T3细胞不经任何因素处理空白对照；组: NIH3T3细胞不加mtDNA片段转染假转染对照； 组:NIH3T3细胞加

6、癌细胞来源的mtDNA片段转染； 组: NIH3T3细胞加白细胞来源的mtDNA片段转染。    6.基因转染:将0.8 ml细胞悬液(4×106/ml)转移至无菌转染杯中，加入10 g mtDNA片段(30 l TE液溶解，组只加30 l空白TE液),混匀，室温静置10 min；将转染杯置于基因脉冲仪(Bio-Rad)的放电槽中，800 V电击0.4 ms，室温静置10 min，分装重新培养，倒置显微镜下对比观察各组细胞的增殖活力和饱和密度变化。    7.染色体制备及G显带：取组和转染后培养1周的、组

7、细胞，参照吴秉铨介绍的方法5进行。结果判断：以20对染色体核型为二倍体，多于或少于20对者为异倍体。    8.荧光原位杂交(FISH)：采用步骤4的白细胞mtDNA为模板，引物1和引物2配对，DIG标记PCR扩增合成1 626 bp mtDNA探针并纯化；参照路建平介绍的方法6进行FISH分析。    9.转化细胞裸小鼠体内接种及病理观察：组和转染后培养2周的、 组细胞各取4×106个,用0.8 ml含15%小牛血清的RPMI-1640培养液悬浮,等分后接种于裸小鼠右腋部皮下,每组2只。作好标记，饲养2

8、3个月，观察裸小鼠的存活及肿块生长情况。对形成肿瘤进行大体形态、光镜及电镜观察。首次实验结束后，进行包括转染、接种在内的重复实验。    10.统计学方法:采用卡方检验。    结果    1.mtDNA目的基因片段及DIG标记探针电泳分析：两种细胞来源的mtDNA模板经扩增后,获得了1 626 bp的目的基因片段和DIG标记的探针,纯化后引物二聚体及多余的单核苷酸消失(1)。    2.转染细胞生长特性变化：组和组细胞呈单层生长；而组

9、和组细胞在转染24 h后部分死亡，48 h后残余细胞恢复增殖活力，达到饱和密度时呈重叠生长。    1.SPC-A-1细胞mtDNA为模板扩增的目的基因片段；    2.正常人白细胞mtDNA为模板扩增的目的基因片段；    3.正常人白细胞mtDNA为模板扩增的DIG标记探针；    4. DNA/Hind III Marker。    1 1 626 bp mtDNA目的基因片段及DIG标记探

10、针电泳谱    3.转染细胞染色体倍性变化：组和组细胞染色体核型中60%为二倍体，40%为异倍体；而组和组细胞染色体核型中异倍体达90%以上。    4.FISH分析：组和组细胞中期染色体或间期核中均无人mtDNA探针的阳性杂交信号，而组和组部分细胞中期染色体或间期核中出现了阳性杂交信号(25)；组阳性率为20%，组阳性率为18%，两组间差异无显著性。    5.转染细胞在裸小鼠体内的成瘤能力：组和组细胞在裸小鼠皮下形成肿瘤阳性率为0(0/8)；而组和组细胞在裸小鼠皮下形成肿

11、瘤阳性率为100%(8/8)。    6.形成肿瘤的病理变化：组和组细胞的形成肿瘤。大体形态上,表面凹凸不平，呈分叶状，局部有坏死现象，解剖观察可见皮下的分叶结节样肿块(6,7)，包膜不完整，与周围组织有粘连，肿块的切面呈灰白色，质地细腻，似鱼肉样，各脏器未见转移结节灶。光镜下见梭形细胞相互交织，排列紊乱，瘤细胞丰富，大小不一，极性消失，具有显著的异型性，核分裂象多，胶原纤维和血管少见，瘤细胞之间可见少量脂肪细胞。此外，瘤细胞对邻近肌组织有明显的侵袭现象(8,9)。电镜下见瘤细胞核大，畸形，核膜凹凸不平，核染色质分布不均，核仁大，可见较多的双核仁，细胞粗

12、面内质网发达，并有囊状扩张，线粒体较丰富，但发育不良，少量细胞胞质中可见肌微丝，细胞间隙较明显，其中可见极少量胶原纤维(10，11)。    2，3 、组细胞中期染色体或间期核中无人mt DNA探针的阳性杂交信号 FISH×1 200 4，5 、组部分细胞中间染色体或间期核中出现了阳性杂交信号(箭头所示) FISH×1 200 6 组mt DNA-3T3细胞裸小鼠皮下形成肿瘤 7 组mt DNA-3T3细胞裸小鼠皮下形成肿瘤 8 组细胞核分裂象多，异型性显著，瘤细胞间可见较多脂肪细胞，胶原纤维少 HE×400 9 组细胞核分

13、裂象多，异型性显著，瘤细胞侵袭邻近肌组织 HE×400    10 组：瘤细胞核大，畸形，双核仁，核膜凹凸不平 ×4 000    11 组瘤细胞核/质比值明显增大，畸形核，核膜凹凸不平 ×4 000    讨论    1.mtDNA片段的恶性转化效应：线粒体是哺乳动物细胞中唯一含有自身遗传物质的细胞器,同时，它又是各种损伤因子作用的敏感部位。因此，细胞中线粒体损伤导致其中的遗传物质即mtDNA释放事件可能

14、时有发生。 那么，这些游离于细胞质中的mtDNA片段是否也具有类似于肿瘤病毒或活化癌基因那样的致癌活性呢？国内外已对此问题引起了重视7。我们在两次重复性研究中均发现，经mtDNA片段转染的NIH3T3细胞(简称mtDNA-3T3)，在体外培养2周后接种于裸小鼠皮下，历时23个月， 都长出了瘤结节，而未经转染或假转染的NIH3T3细胞，在裸小鼠皮下均未形成瘤结节。 表明mtDNA片段能使NIH3T3细胞发生转化，并能使转化细胞获得体内成瘤能力。病理观察发现,mtDNA-3T3细胞所形成的瘤结节，与纤维肉瘤的病理特征一致8。表明mtDNA片段能使NIH3T3细胞发生恶性转化。我们通过设立癌细胞来源

15、和正常细胞来源的mtDNA片段进行转染的对比分析，结果发现它们的转化活力差异无显著性。由此推测，生理状态下任何细胞的mtDNA游离片段都可能具有潜在的转化活性。    2.mtDNA片段诱导细胞恶性转化的机理：众多研究表明，外源性核酸诱发宿主细胞恶性转化,是通过遗传信息在宿主细胞核DNA中整合来实现的9。整合结果使宿主细胞形成了转化基因，从而产生一种或数种转化蛋白。这些转化蛋白在促发细胞转化和维持细胞的转化状态方面发挥了重要作用。通常，在肿瘤病毒感染宿主细胞3648 h就可以使宿主细胞发生明显的转化。我们发现，在mtDNA片段转染NIH3T3细胞后第7

16、d时，mtDNA-3T3细胞染色体核型已发生了显著变化，表现为异倍体细胞明显增加。与此同时，在mtDNA-3T3细胞中期染色体或间期核中， mtDNA探针杂交出现阳性信号者占18%20%，对照组全为阴性。结果表明，经电脉冲方法导入NIH3T3细胞胞质中的 mtDNA片段，可自发地向细胞核内移动并整合于核基因组中，这种整合与mtDNA-3T3细胞的恶性转化密切相关。    成纤维细胞来自中胚层，具有多向分化的潜能。当它遇到合适的刺激，便可分化成脂肪细胞、结缔组织细胞、肌细胞等10。我们发现，mtDNA-3T3细胞形成的肿瘤中可见少量脂肪细胞和肌样细胞， 表

17、明mtDNA片段不仅是一种恶性转化的促发因子，也可以引起细胞多向分化。 同时，也证明mtDNA片段在受体细胞核中的整合是随机的。这与DNA病毒在宿主细胞核DNA中整合的方式相近似。由此可见,mtDNA片段在核基因组中的随机自发整合是促发细胞癌变的又一因素。 关于mtDNA片段与核基因组整合诱导细胞恶性转化的下游机制尚有待深入探讨。    基金项目：国家自然科学基金资助项目(39500173)    胡义德(Email: floride)    作者单位：胡义德 第三军医大学新

18、桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400037    钱桂生 第三军医大学新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400037    毛宝龄 第三军医大学新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400037    肖桃元 第三军医大学新桥医院基础部，重庆 400037    李 懿 第三军医大学新桥医院基础部，重庆 400037    曹世龙 上海医科大学    参考文献

19、    1Liang BC. Evidence for association of mitochondrial DNA sequence amplification and nuclear localization in human low-grade gliomas. Mutat Res,1996,354:27-33.    2索振河,苏伟,吴?. 线粒体DNA可以致癌吗？国外医学遗传学分册, 1994,12:298-301.    3胡义德,钱桂生,陈维中,等. 一步法快速制备培养细胞线粒体DNA. 中华医学遗传学杂志, 1997, 14:250-251.    4胡义德,钱桂生,李淑平,等. 人白细胞线粒体DNA的快速分离与鉴定. 中华血液学杂志, 1997,18:605-606.    5吴秉铨. 肿瘤细胞特征及其行为. 见:王蘅文,主编. 实用肿瘤学基础. 北京:人民卫生出版社, 1992.176-189.    6路建平, 主编. 非放射性杂交技术. 海口: 海