TaqMan-MGB探针双重荧光定量PCR方法绝对定量MDV-Ⅰ和HVT

1、TaqMan-MGB探针双重荧光定量PCR方法绝对定量MDV-和HVT    英文题名 Absolute Quantitation of Marek s Disease Virus and Herpesvirus of Turkeys Using Real-time Duplex PCR of TaqMan-MGB Probe  关键词 马立克氏病病毒; UL36和Bcl-2基因; TaqMan-MGB; 双重FQ-PCR; 英文关键词 Mareks Disease Virus; UL36 and Bcl-2 gene; TaqMan-MGB;

2、 Real-time Duplex PCR; 中文摘要 马立克氏病(Mareks Disease,MD)是由马立克氏病病毒(Mareks Disease Virus,MDV)引起鸡的一种恶性淋巴肿瘤性疾病,具有高度接触传染性。由于该癌症病的隐蔽性极强,又没有治疗手段,其主要预防措施是1日龄内接种疫苗。但疫苗仅阻止发病而非感染,因此对MDV的感染或污染进行特异性的诊断和监测十分重要。TaqMan-MGB实时荧光定量PCR(FQ-PCR)技术具有快速、灵敏、特异、特别是可以定量测定病毒拷贝数的优点为检测MDV提供了很好的方法。 本试验根据GenBank上的型马立克氏病病毒(MDV-1) UL36基

3、因和火鸡疱疹病毒(HVT)Bcl-2基因序列,用Primer Express 3.0软件分别设计了MDV-1和MDV-3的特异性引物和TaqMan-MGB探针,根据距阵优势法分别对引物和探针的浓度进行了优化,并在不同退火温度和不同循环数下进行了优化反应,确立了最佳反应体系和反应条件,通过双重实时荧光定量PCR的不交叉反应,最终建立了MDV-1和MDV-3的TaqMan-MGB探针双重实时荧光定量PCR方法。该方法特异性强,对新城疫病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性. 英文摘要 Marek s disease (MD) is a highly contagious amalignant lymph

4、oma of chickens, caused by Marek s disease virus (MDV) . Due to the crypticity of this cancer disease and lack of therapeutic tool, vaccine inoculation at 1 day old of chicken was regarded as one of main proventive measures. However, vaccine inoculation prevents death other than infection in infecte

5、d chicken, it is very important to diagnose and monitor the status of MDV infection or contamination. TaqMan-MGB FQ-PCR characterized by quick 摘要 4-6 ABSTRACT 6-7 文献综述 14-25     1 马立克氏病的研究进展 14-19         1.1 MD 病原学 14-15     

6、0;   1.2 MD 的发病机理 15-17         1.3 MDV 的基因组学和蛋白组学 17-18         1.4 MDV 的毒力演化 18-19     2 马立克氏病疫苗的研究进展 19-21         2.1 疫苗类型 19       

7、0; 2.2 MD 疫苗的免疫机理 19-20         2.3 MD 疫苗抗肿瘤作用的可能机理 20         2.4 马立克氏病疫苗免疫失败的主要原因 20-21     3 实时荧光定量PCR 技术(FQ-PCR)的研究进展 21-24         3.1 原理 21-22      &

8、#160;  3.2 荧光定量方法的类型 22-23         3.3 实时荧光定量PCR 技术的应用 23-24     4 结语 24-25 试验部分 25-54     1 引言 25-26     2 材料与方法 26-38         2.1 材料 26-28       

9、60;     2.1.1 毒株、菌种与质粒 26             2.1.2 主要试剂 26             2.1.3 主要仪器 26             2.1.4 鸡胚和实验动物 26  &#

10、160;          2.1.5 临床病料 26-27             2.1.6 试剂配制 27-28         2.2 方法 28-38             2.2.1 MDV-1 UL36

11、基因和MDV-3 Bcl-2 蛋白基因的克隆与序列测定 28-32             2.2.2 MDV 双重荧光定量PCR 标准品的建立 32-36             2.2.3 临床发病鸡AGP、PCR 及FQ-PCR 的检测 36            

12、; 2.2.4 实验免疫攻毒鸡羽囊病毒的检测 36-38     3 结果与分析 38-51         3.1 MDV-1 UL36 基因和MDV-3 Bcl-2 蛋白基因的克隆与测序结果 38-41             3.1.1 UL36 基因和Bcl-2 蛋白基因的PCR 扩增 38        &#

13、160;    3.1.2 重组质粒的鉴定 38-40             3.1.3 DNA 测序结果与原始序列的比较 40-41         3.2 MDV 双重荧光定量PCR 标准品的建立 41-47             3.2.1 pBJ-U 和pHV-B 阳

14、性质粒OD 值的测定结果 41             3.2.2 pBJ-U 和pHV-B 阳性质粒DNA 拷贝数的计算结果 41             3.2.3 荧光PCR 引物扩增目的片段的验证 41-42             3.2.4 双重定量PCR

15、不交叉反应的试验结果 42-43             3.2.5 MDV 双重FQ-PCR 检测方法的稳定性试验结果 43-44             3.2.6 MDV 双重FQ-PCR 检测方法的敏感性试验结果 44-46             3.2.7

16、MDV 双重FQ-PCR 检测方法的特异性试验结果 46-47         3.3 临床发病鸡的AGP、PCR 和FQ-PCR 检测结果 47-48             3.3.1 羽囊AGP 检测结果 47             3.3.2 临床发病鸡的PCR 和FQ-PCR 检测结果 47-48

17、         3.4 实验免疫攻毒鸡的AGP 和FQ-PCR 的检测 48-51             3.4.1 羽囊的AGP 检测结果 48             3.4.2 荧光定量PCR 检测结果 48-51     4 讨论 51-54   

18、      4.1 MDV 双重荧光定量PCR 方法的建立 51-52         4.2 临床发病鸡不同组织样品的检测 52         4.3 FQ-PCR 对实验免疫攻毒鸡羽囊样品的检测 52-54 结论 54-55 参考文献 55-60 致谢 60-61             2.

19、1.5 临床病料 26-27             2.1.6 试剂配制 27-28         2.2 方法 28-38             2.2.1 MDV-1 UL36 基因和MDV-3 Bcl-2 蛋白基因的克隆与序列测定 28-32     

20、60;       2.2.2 MDV 双重荧光定量PCR 标准品的建立 32-36             2.2.3 临床发病鸡AGP、PCR 及FQ-PCR 的检测 36             2.2.4 实验免疫攻毒鸡羽囊病毒的检测 36-38     3 结果与分析 38-51

21、         3.1 MDV-1 UL36 基因和MDV-3 Bcl-2 蛋白基因的克隆与测序结果 38-41             3.1.1 UL36 基因和Bcl-2 蛋白基因的PCR 扩增 38             3.1.2 重组质粒的鉴定 38-40    

22、         3.1.3 DNA 测序结果与原始序列的比较 40-41         3.2 MDV 双重荧光定量PCR 标准品的建立 41-47             3.2.1 pBJ-U 和pHV-B 阳性质粒OD 值的测定结果 41        

23、60;    3.2.2 pBJ-U 和pHV-B 阳性质粒DNA 拷贝数的计算结果 41             3.2.3 荧光PCR 引物扩增目的片段的验证 41-42             3.2.4 双重定量PCR 不交叉反应的试验结果 42-43        &#

24、160;    3.2.5 MDV 双重FQ-PCR 检测方法的稳定性试验结果 43-44             3.2.6 MDV 双重FQ-PCR 检测方法的敏感性试验结果 44-46             3.2.7 MDV 双重FQ-PCR 检测方法的特异性试验结果 46-47      

25、;   3.3 临床发病鸡的AGP、PCR 和FQ-PCR 检测结果 47-48             3.3.1 羽囊AGP 检测结果 47             3.3.2 临床发病鸡的PCR 和FQ-PCR 检测结果 47-48         3.4 实验免疫攻毒鸡的AGP 和

26、FQ-PCR 的检测 48-51             3.4.1 羽囊的AGP 检测结果 48             3.4.2 荧光定量PCR 检测结果 48-51     4 讨论 51-54         4.1 MDV 双重荧光定量PCR 方法的建立 51-52

27、        4.2 临床发病鸡不同组织样品的检测 52         4.3 FQ-PCR 对实验免疫攻毒鸡羽囊样品的检测 52-54 结论 54-55 参考文献 55-60 致谢 60-61             2.1.5 临床病料 26-27        

28、0;    2.1.6 试剂配制 27-28         2.2 方法 28-38             2.2.1 MDV-1 UL36 基因和MDV-3 Bcl-2 蛋白基因的克隆与序列测定 28-32             2.2.2 MDV 双重荧光定量PCR 标

29、准品的建立 32-36             2.2.3 临床发病鸡AGP、PCR 及FQ-PCR 的检测 36             2.2.4 实验免疫攻毒鸡羽囊病毒的检测 36-38     3 结果与分析 38-51         3.1 MDV-1 UL36 基因

30、和MDV-3 Bcl-2 蛋白基因的克隆与测序结果 38-41             3.1.1 UL36 基因和Bcl-2 蛋白基因的PCR 扩增 38             3.1.2 重组质粒的鉴定 38-40             3.1.3 DNA 测序

31、结果与原始序列的比较 40-41         3.2 MDV 双重荧光定量PCR 标准品的建立 41-47             3.2.1 pBJ-U 和pHV-B 阳性质粒OD 值的测定结果 41             3.2.2 pBJ-U 和pHV-B 阳性质粒DNA 拷贝数的计算结果 41             3.2.3 荧光PCR 引物扩增目的片段的验证 41-42             3.2.4 双重定量PCR 不交叉反应的试验结果 42-43