鸡卵类粘蛋白的分离纯化及活力测定

1、鸡卵类粘蛋白的分离纯化及活力测定时韦美 王宇 王彦坤 唐玮 （河北大学 生命科学学院 08生物工程，河北 保定,071002）摘要：鸡卵类粘蛋白(chickenovomucoid简称CHOM)是由鸡卵清中制成的一种糖蛋白，它具有强烈的抑制胰蛋白酶的作用。采用有机溶剂沉淀法将鸡蛋清经三氯乙酸（TCA）丙酮溶液处理，除去沉淀物，经丙酮分级沉淀活的粗品，再经过DEAE纤维素（二乙基氨基乙基纤维素）柱层析纯化而得合格产品，通过聚丙烯酰胺凝焦电泳进行鸡卵类粘蛋白的活力测定。关键词：鸡卵类粘蛋白; 胰蛋白酶; 有机溶剂 ;层析; 电泳中图分类号：Q 文献标识码：AThe isolation and pur

2、ification of CHOM and determined of its activityShi Wei-mei，Wang Yu，Wang Yan-kun，Tang Wei(Biology engineering in Grade 2008,College of Life Sciences,Hebei University,Baoding,Hebei,071002)Abstract: chicken ovomucoid (CHOM) is a glycoprotein made of chicken-egg, it has a strong role in inhibiting tryp

3、sin. Using organic solvent like TCA-acetone solution to deal with chicken-egg, remove sediments by acetone, purify it through DEAE cellLose (2-ethyl ethyl cellLose ) column chromatograpHy, the activity is determined by PAGE.Key words: CHOM ;Trypsin ; organic solvent ; chromatogram ; electropHoresis;

4、鸡卵类粘蛋白(chickenovomucoid简称CHOM)是由鸡卵清中制成的一种糖蛋白，它具有强烈的抑制胰蛋白酶的作用1，常用于胰蛋白酶的酶学性质的研究。也可将其制成吸附亲合剂，通过亲和层析技术有效的分离和纯化胰蛋白酶。卵类粘蛋白在中性或酸性溶液中对热度和高浓度的脲都是相当稳定的，在有机溶剂都有较高耐受性（在50% 丙酮或10% 三氯乙酸溶液中仍有较好的溶解度），而在碱性溶液中比较不稳定，尤其当温度较高时易迅速失活。鸡卵类粘蛋白的等电点有一定的范围，大致在pH 3.94.5。分子量M 28000。采用有机溶剂沉淀法分级沉淀活的粗品。鸡卵类粘蛋白具有强烈的抑制胰蛋白酶的作用;胰蛋白酶能水解酯键

5、,酰胺键和肽键,利用这一性质用人工合成的底物或天然的蛋白质可以测定胰蛋白酶的活力,由此可计算卵类粘蛋白的活力.。1 材料与方法 11 材料：111 试剂丙酮;0.5 M三氯乙酸;0.02 M,pH 6.5磷酸缓冲液;DEAE-纤维素;0.5 M氯化钠-0.5 M氢氧化钠溶液;0.5 M盐酸;0.30 M氯化钠-0.02 M,pH 6.5磷酸盐缓冲液;1.0 M氯化钠-0.02 M,pH 6.5磷酸盐溶液;蔗糖;0.001 M盐酸;ATEE-0.05 M,pH 7.0磷酸盐缓冲液（每毫升磷酸盐缓冲液含0.25毫克ATEE）;0.05 M,pH 8.0Tris-HcL缓冲液;结晶胰蛋白酶溶液（0.

6、001 M HCl配制）;a-胰凝乳蛋白溶液（用结晶0.001 M HCl 配制）;0.4 M Na2C03(无离子水配制);0.4 M 三氯乙酸;2% 酪蛋白溶液;Folin乙试剂;胶母液;10%过硫酸铵;pH 8.9Tris-HCl缓冲液;pH 6.7Tris-HCl缓冲液;pH 8.3Tris-Gly电极缓冲液;样品液;0.05%考马斯亮蓝R250染液;脱色液112 器材新鲜鸡蛋、恒温水浴锅、温度计、抽滤瓶、布氏漏斗、透析袋、层析柱（1.0*20 cm）、可见分光光度计、部分收集器、紫外检测仪（包括记录装置）、贮液瓶（柱层洗洗脱用）、秒表、垂直板电泳槽（六一产的）、凝胶膜（135*100

7、*1.0mm）、样品梳、试管及试管夹、三角瓶、微量取样器、平皿、广泛pH试纸、移液管、高速冷冻离心机、电磁炉、直流稳压电源、滤纸（7cm）12 方法：1.21 粗品的制备：(1)30.00 mL鸡蛋清放于100 mL烧杯中；(2) 放置于温水浴锅内使温度达到25-30，在不断搅拌下加入等体积的4预冷的 三氯乙酸-丙酮溶液（体积比1：2），形成类似于酸奶状的白色沉淀调pH到3-3.5，搅拌约30min，4下放置一小时1 ；(3) 4000r/min离心20min，得22.3mL黄绿色上清液于500mL烧杯中，边搅拌边加入2倍于上清液体积的4预冷的丙酮，产生白色沉淀，在冰箱中放置1小时，4000r

8、/min 离心20min，弃清液，沉淀物加入2mL离子水，溶解沉淀，装入透析袋中对水透析以除去残留的TCA,抽气除去残留丙酮。4000r/min 离心20min，弃沉淀，量取溶液体积为13mL。(4)加入1/10体积（即1.3mL）的0.2 M pH 6.5 PBS，摇匀，测量并记录粗品体积14.3mL，供下步上柱纯化使用。122 DEAE柱纯化：(1) DEAE-纤维素的处理及再生（本步老师完成）新纤维素的处理：取50克DEAE-纤维素32，用少量水溶胀1小时，用0.5M氯化钠溶液-0.5M氢氧化钠溶液搅拌处理30min，用大量的蒸馏水洗至中性，再用0.5M盐酸和0.5M氯化钠溶液搅拌处理3

9、0min，用大量的蒸馏水洗至中性，再用0.5M氯化钠溶液-0.5M氢氧化钠溶液处理一次，最后用大量的蒸馏水洗至中性，放置冰箱中保存。旧纤维素的再生：只用0.5M氯化钠溶液-0.5M氢氧化钠溶液处理一次，用大量蒸馏水洗至中性，放置冰箱中保存。 （2）装柱：层析柱垂直安装在铁架台上。先加入1/2柱体积的水，取一合适的玻璃漏斗安装在柱上端。将处理好的DEAE-纤维素连同水倒入漏斗，不断搅拌使之自然沉降到1cm左右的高度。打开柱下端的硅胶管，搅拌至沉降到柱高的3/4高度(10.2cm)，将硅胶管连接在核酸蛋白检测仪样品池的入口，打开核酸蛋白检测仪电源，预热30分钟。（3）平衡：用0.02 M pH 6

10、.5磷酸盐缓冲液平衡层析柱，用三倍柱体积的0.02 M pH 6.5磷酸盐缓冲液平衡，连接核酸蛋白检测仪，记录流出速度（1.1mL/min）。始终保持柱床上有2cm高度的缓冲液，注意不能干柱。平衡过程中，调试核酸蛋白检测仪。首先将旋钮调到T100%，调“光量”到显示100，再将旋钮拨到A，调节“调零”到显示0。继续平衡，如数字有波动，反复调节，使A保持为0。 （4）上样及洗脱：待柱床上方的缓冲液快流尽时，立即贴壁加1mL样品，使样品缓慢流下，再加0.02M pH6.5磷酸盐缓冲液到柱上边至2cm的高度。继续平衡，观察核酸蛋白检测仪的A值变化。当A值急剧上升时，计时并记录数值于表6中，收集流出液

11、。当A值上升到最高值时，计时并记录数值，下降到数值保持稳定时改用0.3M氯化钠-0.02M pH6.5磷酸盐缓冲液洗脱1，同上，计时并记录数值，收集流出液。脱过程中，根据吸光度值的变化收集蛋白峰，即为卵类粘蛋白部分。（图1）将收集到的溶液放在透析袋中，先对水透析，再用蔗糖浓缩到2-3mL.1.2.3酶活力测定（1）粘蛋白对胰蛋白酶的抑制1和1：0.5mL胰蛋白酶溶液（0.4mg/mL）+0.5mL水；2和2：0.5mL粘蛋白粗品+0.5mL胰蛋白酶溶液（0.4mg/mL），调pH=8.0 40保温20分钟；3和3：0.5mL粘蛋白纯品+0.5mL胰蛋白酶溶液（0.4mg/mL），调pH=8.0

12、 40保温20分钟。取6支试管，如上所述，使粗品和纯品在PH8.0条件下，充分与胰蛋白酶结合，抑制其活性。经抑制后，按表1所列顺序加样。(2)胰酶及粘蛋白酶抑制剂后对酪蛋白底物的水解表1 胰蛋白酶及粘蛋白抑制后水解酪蛋白底物加样表管号112233样品（mL)1.01.01.01.01.01.040预热5min0.4M三氯乙酸(mL)2.002.002.002%酪蛋白1.01.01.01.01.01.040继续水浴10 min0.4M三氯乙酸(mL)02.002.002.040继续水浴10 min ,7cm滤纸过滤，得滤液 (3)各管酶促反应滤液与Folin-酚试剂反应另取6支试管按表2加样。表

13、2 各管酶促反应滤液与Folin-酚试剂反应加样表112233表1滤液（mL）1.01.01.01.01.01.00.4M碳酸钠（mL）5.05.05.05.05.05.0Folin乙试剂（mL）1.01.01.01.01.01.040水浴20min后，测定A680nmA680nm0？0？0？活力及剩余单位数（U）？粘蛋白抑制活力？注：在测定A680nm时，以1调0测1； 以2调0测2； 以3调0测3。(4)酶活力单位定义及计算公式酶活力单位U：40下，每min每mL酶液水解干酪素产生1微克酪氨酸所需的酶量。计算公式：酶活力单位=OD*4/10*n*kOD：1mL酶促反应液测得的OD680OD

14、: 1毫升酶促反应液测得的OD A680值；4：酶促反应体积；10：酶促反应时间;n：酶液稀释倍数，（本实验中n为1，各管内含胰蛋白酶均为1mL，2mg/mL的胰蛋白酶溶液）k：一个OD值相当于酪氨酸的微克数，本实验取102。123 SDS-PAGE检测鸡卵类粘蛋白的纯化与活性(1)配胶不加酪蛋白的分离胶的配制：确定所需凝胶溶液体积，在一小烧杯中按表3从上到下顺序配制分离胶溶液。表3 10%分离胶的配制总体积5 mL30%胶母液（mL）1.65pH8.9buffer含SDS，TEMED（mL）1.25无离子水（mL）2.110%APS（L）40立即混匀，迅速将其灌注在玻璃板的缝隙内（约2/3高

15、），最后用微量取样器将100L水加在胶液面上，约2-3mm厚水封隔氧。待分离胶完成后（约30分钟后），倾出覆盖水层，用滤纸吸净残留水。浓缩胶的配制：按表4数据配制表4 3.6%浓缩胶的配制总体积2 mL30%胶母液（mL）0.24pH6.7buffer含SDS，TEMED（mL）0.5无离子水（mL）0.910%APS（L）30在玻璃板上面1/3灌注浓缩胶。立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子，注意梳子正反面，小心避免气泡，待凝。对样品进行处理：粗品（25L）、纯品(25L)、BSA(15L)分别与样品处理液按体积比1：1混合，和Marker一起在100水浴加热5分钟，使蛋白质充分变性并与SDS结

16、合。 (2)点样表5 点样表点样孔12345678910样品粗品粗品粗品粗品MarkerBSA纯品纯品纯品纯品点样量(L)10 6421620361020 (3)电泳将电泳槽和电源相连，调节好电源电压100V，待样品进入分离胶后调节电压150V。待电泳完毕后，调节电压为0，关闭电源。从电泳装置上卸下玻璃板，撬开玻璃板。取下凝胶，切下右下角做记号。放入平皿中。 (4)染色将考马斯亮蓝R250染色液加入平皿，没过凝胶，脱色摇床震荡染液10分钟，用滴管将染色液回收到试剂瓶。（5）脱色用水洗去凝胶表面的浮色，弃水，加入脱色液，脱色至凝胶背景的蓝色退去。测量相对迁移率，绘图 (6)观察结果扫描拍照，如图

17、2。2 结果与分析 2.1 结果2.1.1鸡蛋类粘蛋白的纯化：对蛋白粗品进行离子交换层系的时候，每隔一段时间便记下吸光度的值，当吸光度的值达到一定高度不再上升反而下降时，及时地用离心管收集下当时的洗脱液，即收集蛋白峰所对应的蛋白卵类粘蛋白，已达到纯化蛋白的目的。 在本实验中，DEAE柱层析时洗脱液的流速为1.1 mL/min。表6 离子柱层析蛋白峰收集表时间吸光度时间吸光度时间吸光度时间吸光度时间吸光度时间吸光度0:00:0040:05:00810:10:00830:15:00600:20:00520:25:00380:00:1540:05:15760:10:15880:15:15760:20

18、:15580:25:15430:00:3040:05:30740:10:30800:15:30660:20:30500:25:30330:00:4540:05:45760:10:45800:15:45690:20:45510:25:45360:01:0050:06:00770:11:00640:16:00710:21:00460:26:00410:01:1570:06:15800:11:15660:16:15670:21:15470:26:15350:01:30120:06:30740:11:30700:16:30590:21:30520:26:30310:01:45210:06:45730:

19、11:45670:16:45660:21:45530:26:45350:02:00410:07:00660:12:00770:17:00710:22:00460:27:00370:02:15720:07:15640:12:15700:17:15600:22:15500:27:15280:02:30880:07:30670:12:30750:17:30630:22:30420:27:30330:02:45930:07:45800:12:45750:17:45540:22:45450:27:45340:03:00940:08:00720:13:00770:18:00510:23:00490:28:

20、00320:03:15940:08:15720:13:15640:18:15570:23:15420:28:15300:03:30940:08:30890:13:30750:18:30590:23:30440:28:30260:03:45930:08:45770:13:45720:18:45610:23:45450:28:45240:04:00950:09:00890:14:00750:19:00570:24:00360:29:00230:04:15980:09:15770:14:15710:19:15560:24:15430:29:15240:04:30970:09:30890:14:306

21、70:19:30580:24:30450:29:30290:04:45900:09:45870:14:45680:19:45510:24:45380:29:4523分析：（1）之前用0.02M pH6.5磷酸盐缓冲液洗脱粗品时，吸收峰并无变化，一直维持在0水平，说明粗品基本已经除去；（2）吸收峰在迅速升起后，并为迅速下降，而是呈波浪型曲折下降，原因或为：加洗脱液时不稳定，造成压力不恒定，致使流速不恒定而造成，洗脱液的成分有变化，有杂质，不纯，造成洗脱不好，洗脱液配比并不适于此次洗脱加样量过大，造成与柱结合的类粘蛋白较多，不易短时间内全部洗脱。改进：适量减少加样量，使其易于全部洗脱；另外，做不同

22、浓度配比的洗脱液，使其更易于洗脱目标产物；加洗脱液时，尽量保持恒定速度，减少或降低不稳定因素。2.1.2 Folin-酚法测定胰蛋白酶的酶活力及卵粘蛋白的抑制活力(1)由酶活力的计算公式得 表7表7 酶活力及卵类粘蛋白的抑制活力表112233A680nm00.4000.3300.36活力及剩余单位数（U）16.32013.46414.688粘蛋白抑制活力2.8561.632(2)通过计算得纯化总表,表8。总活力=总体积每毫升的抑制活力收率=纯品的总抑制活力粗品的总抑制活力表8 纯化总表步骤总体积/mL总活力/U收率丙酮-TCA粗提14.381.682100%DEAE-CellLose1.44.

23、5705.59%分析：活力也较低，原因或为实验中间持续时间过长，类粘蛋白已有很大一部分失活；收率较低，原因或是DEAE-CellLose 中吸附有大量的类粘蛋白。改进：尽量缩短实验时间，减少类粘蛋白的自然分解；或改进保存条件，使其自然分解减少；改进洗脱装置。2.1.3 SDS-聚丙烯胺凝胶电泳测定类粘蛋白分子量 （1）经过考马斯亮蓝染色及脱色剂脱色，照相后结果如图2：123 4 56 7 8 9 10图2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图图注：各泳道分别为 1：20L粗品； 2：10L粗品； 3：6L粗品； 4：3L粗品； 5：16L Marker;6:20L BSA; 7:3L纯品； 8：6L纯

24、品； 9：10L纯品； 10：20L纯品；染色结束后，测量蛋白质及示踪染料的迁移距离，见表9。蛋白质的迁移距离是指从分离胶的起始位到蛋白质条带的前缘。表9 各蛋白质迁移率及分子量BSA纯品Marker123456平均距离（cm）1.001.750.551.001.452.002.502.60迁移率0.2900.5070.1590.2900.4200.5800.7250.754分子量6620034793 974006620043000310002010014400分子量对数4.82094.54154.98864.82094.63354.49144.30324.1584计算Rf值：Rf=蛋白质的迁

25、移距离/示踪染料的迁移距离，蛋白质的前一距离为分离胶界面到蛋白质条带的实际位置的距离。示踪染液迁移距离Y=3.45cm，纯品粘蛋白平均迁移距离X=1.75cm，Rf=0.507。 （2）绘制标准蛋白质分子量对数与相对迁移率的标准曲线本试验使用的是第分子量标准蛋白Marker，由6种标准蛋白组成，以已知蛋白质分子量的常数值为纵坐标，Rf为横坐标绘图，可得到一条直线，求出回归方程。Marker的相对分子质量与Rf关系见表10 表10 Marker中蛋白的相对分子质量的对数与Rf的关系表蛋白质名称兔磷酸化酶BSA兔肌动蛋白牛碳酸杆酶胰蛋白酶抑制剂鸡血清溶菌酶分子质量97400662004300031

26、0002010014400相对分子质量的对数4.9884.8214.6334.4914.3034.158Marker中蛋白的相对分子质量的对数与Rf的关系可表示如图3所示由图中公式，y = -1.2929x + 5.197代入纯蛋白迁移率，得纯类粘蛋白的分子量为34793。分析：电泳条带不齐，原因或为分离胶浓度不均，或倒胶时，里面的水未全部清除干净，造成部分稀释，导致此结果；部分背景呈暗色，原因或为脱色不完全，还留有考马斯亮蓝。改进：配胶时，摇匀，倒胶时，将水清理干净；脱色时，加长脱色时间，并加大脱色液的用量。3 讨论（1） 在向蛋清中加入有机溶剂（三氯乙酸-丙酮溶液（体积比1：2）时，要不断搅拌，这样，才能使蛋白充分分离，并