PCRSSCP法检测非小细胞肺癌中FADD基因突变的研究

1、PCRSSCP法检测非小细胞肺癌中FADD基因突变的研究     【摘要】  检测Fas相关死亡结构域蛋白（Fasassociated death domain protein，FADD）基因在人非小细胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）中的突变情况，以探讨该基因在肺癌发生发展中的作用及机制。方法 采用聚合酶链反应单链构象多态性分析（polymerase chain reaction and singlestrand conformation polymorphism, PCRSSCP）检测74例NSCLC原

2、发灶癌组织及13例癌旁正常肺组织中FADD基因突变情况。结果 74例NSCLC组织中检出5例发生FADD基因突变，FADD基因突变与癌的淋巴结转移呈显著正相关（rs=0.378，P=0.001），与其他临床病理特征无关。结论 NSCLC中存在着FADD基因突变。FADD基因突变在NSCLC的发生发展中可能起着重要作用。 【关键词】  肺肿瘤 突变 FADD基因 PCRSSCP0  引言    肺癌组织中癌细胞凋亡水平受抑是肺癌发生发展的重要机制之一，涉及到一系列凋亡相关基因的改变及异常表达1,2。参与调控细胞凋亡的蛋白很多，研究证实Fas相关死

3、亡结构域蛋白（Fasassociated death domain protein，FADD）是一种具有普遍意义的死亡结构域蛋白，在多种细胞表面死亡受体介导的细胞凋亡过程中起着关键作用35。NSCLC中存在着多种凋亡相关基因的突变6，而有关肺癌组织中FADD基因突变的研究，国内外报道尚为少见。为此，我们应用PCRSSCP技术检测FADD基因在NSCLC中的突变情况，以探讨该基因在肺癌发生发展中的作用及机制。1  资料与方法1.1  标本  62例肺癌组织及13例癌旁正常组织标本取自武汉大学医学院病理教研室存档的1998年1月2002年7月的组织蜡块，12例新鲜肺癌

4、组织为2002年6月2003年3月武汉大学人民医院胸外科手术切除标本。男性50例，女性24例；年龄4371岁，中位年龄56岁。按照WHO标准（1999年第3版）进行组织学分类，鳞癌31例，腺癌43例；按国际抗癌联盟（UICC，1997年第5版）TNM分期，T1期17例，T2期17例，T3期21例，T4期19例；N0期31例，N1期25例，N2期18例。1.2  模板DNA的提取  石蜡包埋组织模板DNA的提取参考文献7进行。新鲜肺癌组织DNA抽提，具体方法参见分子克隆酚氯仿抽提法。1.3  PCPSSCP银染  我们选取FADD基因的第一外显子区域扩增，

5、其引物序列，见表1。50l反应体系，含1×PCR缓冲液，1.5mmol/L Mgcl2，0.2mmol/L dNTPs，0.5mol/L 引物，5l模板，2u Taq酶；PCR扩增反应条件为：94预变性12min；94变性30s，5060退火30s，72延伸30s， 35个循环； 72延伸5min。扩增完毕后，取6l PCR产物于2琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增成功并无非特异性扩增后，再作SSCP。取34l PCR产物，加9l H2O及1.5l 10×碱变性液（NaOH 0.5mol/L，EDTA 10mmol/L），37孵育10min后加1.5l变性上样缓冲液（98去离子甲酰胺、

6、10mmol/L EDTA、0.25溴酚篮），吸取10l上样于8聚丙烯酰胺凝胶（291），同等量100bp DNA Marker作分子量对照。15V/cm电泳10min后，将电泳槽置于冰水浴，12V/cm电泳直至溴酚篮到达凝胶底部。电泳结束后，小心取下凝胶，行银染。与正常对照相比，有异常泳动条带者判断为基因外显子突变。表1  FADD基因外显子1的PCR引物序列（略）1.4  统计学处理  本组所得数据采用2检验和Spearman相关分析，数据统计在SPSS10.0软件上进行，以P<0.05为有统计学意义。2  结果  

7、0; FADD基因第一外显子在74例NSCLC组织和13例癌旁正常肺组织中均全部扩增成功，见图1；癌组织中FADD基因第一外显子扩增产物有5例出现异常泳动条带(6.8%)，而在13例癌旁肺组织扩增产物中未显示异常，见图2。5例检出突变的标本均为有淋巴结转移的肺癌。NSCLC组织中FADD基因突变与肺癌的组织学类型、T分期均无显著相关，但与淋巴结转移呈显著相关，N分期越高者，发生FADD基因突变概率越高，进一步行Spearman相关分析显示两者呈显著正相关（rs=0.320，P<0.01），见表2。图1  FADD基因第一外显子PCR扩增部分结果（略）M：对照物（1001 000

8、bp）；T12：肺癌组织；N：癌旁非癌肺组织图2  SSCP示FADD基因第一外显子突变（略）M：对照物（1001 000bp）；T12：肺癌组织；N：癌旁非癌肺组织表2  FADD基因突变与肺癌临床特征的关系（略）* 采用确切概率法3  讨论    FADD基因由Kim等81996年克隆定位于人染色体11q13.3，包含两个外显子和一个内含子。其中，FADD基因外显子2编码C端的死亡结构域（death domain, DD），是与Fas和肿瘤坏死因子受体 1( tumor necrosis factor receptor1，TNFR1)等细胞死亡受体的死亡结构域同源的结构域。而外显子1编码N端的死亡效应结构域（death effect domain，DED），该结构域的寡聚化，足以引