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文档简介
1、【摘要】 目的研究大孔吸附树脂分离纯化草珊瑚总黄酮工艺,为草珊瑚总黄酮的工业化生产提供实验依据。方法以贵州产草珊瑚为原料,以草珊瑚总黄酮含量及回收率等为考察指标,选用大孔吸附树脂对草珊瑚总黄酮进行分离纯化,分别采用静态试验、动态试验等考察大孔树脂对草珊瑚总黄酮的分离纯化效果及影响因素。结果AB-8型大孔吸附树脂对草珊瑚总黄酮静态饱和吸附量为116.25 mgg-1(干树脂),洗脱率92.9%,动态饱和吸附量为94.5 mgg-1(干树脂),总黄酮回收率在96.1%、纯度在90%以上,是实验树脂中分离纯化草珊瑚总黄酮的最佳大孔吸附树脂。结论分离纯化草珊瑚总黄酮最佳工艺条件为:AB-8型大孔吸附树
2、脂,洗脱剂为70%乙醇,洗脱剂用量为3倍树脂体积,流速34 ml/min,上柱总黄酮量与树脂比为110.5,上柱液总黄酮浓度为19.8 mg/ml,流速23 ml/min,冲洗杂质用水体积23 BV,上柱液pH值45。 【关键词】 大孔树脂 草珊瑚 总黄酮 分离 纯化Abstract:Objective A method for separation and purification of the flavonoids from Sarcandrae glabra with macroporous resin was studied.MethodsBy using Sarcandrae gla
3、bra in Guizhou and with the content and recovery rate of flavonoids as indexes and the static absorption capacity and the static elution ratio were observed. ResultsThe results were as flollows: The static absorption capacity of AB-8 type resin was 116.25 mgg-1, the static elution ratio was 92.9%, t
4、he dynamic absorption capacity of AB-8 type resin was 94.5 mgg-1, the recovery rate was more than 96.1% and the purity was more than 90%. AB-8 type resin was the best for separating and purificating Sarcandrae glabra in flavonoids.ConclusionThe optimum conditions is: AB-8 type macroporous resin, the
5、 eluant is 70% alcohol and 3 times as the volume of the resin, the volume of the resin is 10.5 times of flavonoids in sample, concentration of flavonoids of sample is 19.8 mgml-1 and current velocity of 23 mlmin-1, pH value of sample is 45.Key words:Macroporous resin; Sarcandrae glabra; Flavonoids;
6、Separation; Purification 草珊瑚Sarcandra glabra ( Thunb. ) Nakai为多年生常绿草本或亚灌木,系金粟兰科草珊瑚属植物,药用全草。在我国长江以南各省均有分布,特别是云、贵、川较为多见。草珊瑚叶苦辛、性温、有小毒,有祛风通络、活血祛淤、止血止痛、接骨续筋之功效,民间常用来治疗风湿痹症,跌打损伤等1及作茶饮用,已有数百年的历史。现代医学,药理、毒理研究表明草珊瑚具有抗菌消炎,抑制多种病原菌,清热解毒,抗多种肿瘤,促进骨折愈合,改善血液循环,镇痛,抗疲劳,抗氧化,抑制流感病毒等多种生物活性2。毒性实验表明草珊瑚及其提取物无毒;动物精子畸性实验,小鼠
7、骨髓细胞微核实验等均为阴性,未发现致突变作用,所以是非常安全的3,4。目前,草珊瑚的加工产品有医药、兽药品,保健品,食用品等数十种之多。黄酮类化合物是草珊瑚中含量最多、最主要的药用有效成分之一2。随着草珊瑚在医药、兽药、保健食品及保健用品领域中的应用越来越广泛,而对草珊瑚总黄酮的分离纯化研究尚未见到系统报道。为了更合理地开发利用草珊瑚资源,本研究以草珊瑚总黄酮含量及回收率等为考察指标,选用大孔吸附树脂分离纯化草珊瑚总黄酮,分别采用静态实验、动态实验等考察大孔树脂对草珊瑚总黄酮的分离纯化效果及影响因素,研究分离纯化草珊瑚总黄酮的最佳工艺条件及各种影响因素。从而为生产中最有效的开发利用草珊瑚、发挥
8、草珊瑚的最大经济效益提供实验依据。1 材料与仪器 草珊瑚全草均采自贵州省江口县同一地点,由本院生物技术重点实验室进行鉴定及采用统一的干燥方法加工制样,避免背景干扰。 所用试剂NaNO2,Al(NO3)3,NaHSO3,NaSO3,EDTA,吐温-80等均为分析纯,乙醇为95%食用酒精,芦丁标准品为美国Sigma公司产品、含量大于98%;大孔吸附树脂: D3520型,AB-8型,NKA-9型,D4020型,S-8型(南开大学化工厂)。 TU-1800紫外可见分光光度计(北京普析),RE52旋转蒸发仪(上海亚荣),不锈钢提取锅(武汉立中),PHSJ3F精密酸度计(上海雷磁),ALG5/10自动灌装
9、封口机(上海国彩),电子天平(美国奥豪斯),恒温水浴箱(上海医疗器械厂);鼓风干燥箱(上海实验仪器厂);植株样本粉碎机(上海实验仪器厂);液体自动混合机(北京长安仪器厂)。2 方法与结果2.1 草珊瑚总黄酮的测定方法草珊瑚总黄酮的测定方法采用芦丁比色法5,测定波长500 nm,回归方程:C=84.317A-0.77361,(r=0.999 8),吸光度线性范围:0.10.6,加样回收的平均回收率99.37%,RSD=1.85%(n=6);精密度测定RSD=0.95%。2.2 草珊瑚总黄酮纯化用样品液的制备取草珊瑚全草(除根)干品粗粉500 g,根据作者已有试验L9(34)正交设计筛选出的草珊瑚
10、总黄酮乙醇浸提最优水平组合工艺:即采用60%乙醇、80温度,3 h/次,提取3次进行提取制备,制得草珊瑚总黄酮提取液(总黄酮含量:9.5 mgml-1)冷藏备用。2.3 大孔吸附树脂的筛选68将D3520型、AB-8型、NKA-9型、D4020型、S-8型树脂先用4倍体积量95%乙醇或丙酮浸洗均可,至浸洗液加适量蒸馏水无白色浑浊现象时止,用水反复清洗干净至无醇味或无酮味,加入4倍体积量2 molL-1的氢氧化钠溶液,浸泡12 h,以水洗至中性;再加入4倍体积量4 molL-1的盐酸,浸泡12 h,用蒸馏水洗至中性后60烘干备用。 精密称取经上述预处理的干树脂1 g共3份,置100 ml三角瓶中
11、,精密加入2.2项下制取的样品液20 ml后震荡吸附,頻率120次/min,1分钟间隔振荡2 h,然后静置20 h,使其达到饱和吸附,吸取上层液测定总黄酮浓度,按下式计算树脂饱和吸附量:饱和吸附量=(初始浓度-吸附后浓度)吸附液体积/树脂量(mgg-1干树脂),取三次平均值。将经静态饱和吸附总黄酮后树脂滤出,吸干表面水分,精密加入60%浓度的乙醇20 ml后同上法震荡2 h后滤出,测定洗脱液总黄酮的浓度,计算洗脱率:洗脱率=洗脱液浓度洗脱液体积/饱和吸附量100%,取3次平均值。结果见表1。表1 5种树脂对草珊瑚总黄酮的静态饱和吸附洗脱结果(略) 上述结果表明5种大孔吸附树脂对草珊瑚总黄酮的静
12、态饱和吸附量均在90 mg以上,以AB-8型树脂静态吸附量最大;在静态洗脱中,AB-8型树脂洗脱率为92.9%,高于其它4种,AB-8型树脂表现出最佳的综合性能。2.4 洗脱剂浓度的筛选精密称取预处理好的AB-8型干树脂1 g共7份,分别置100 ml三角瓶中,精密加入2.2项下制取的样品液20 ml后按2.3项下同法震荡,使其达到饱和吸附,分离树脂,吸干表面水分。对应加入浓度分别为30%,40%,60%,70%,70%,80%,90%的乙醇各20 ml后同法震荡洗脱2 h后过滤出,测定洗脱液总黄酮浓度,计算洗脱率(算法见2.3项下)。结果见表2及图1。表2 乙醇浓度对AB-8型树脂洗脱率的影
13、响 (略) 表2表明, 洗脱剂乙醇浓度增高,洗脱率逐渐增大,70%90%的乙醇洗脱率均在90%以上,而乙醇浓度高易挥发,从经济、安全、节约出发本实验选用70%乙醇为洗脱剂。2.5 pH对AB-8型树脂吸附量的影响精密称取已预处理好的干树脂1 g共8份,各置100 ml三角瓶中,精密加入pH3,4,5,6,7,8,9,10样品液各20 ml按2.3项下同法震荡,使其达到饱和吸附,吸取上层液测定总黄酮浓度,按2.3项下公式计算树脂饱和吸附量。结果见表3及图2。表3 pH对AB-8型树脂饱和吸附量的影响(略) 表3表明,上样液以pH4饱和吸附量最大。2.6 AB-8型树脂对草珊瑚总黄酮的动态吸附-洗
14、脱量测定称取已处理好的AB-8型吸附树脂100 g和20 g,分别湿法装入3 cm500 cm的色谱柱中,将2.2项下制取的草珊瑚提取液330 ml(9.5 mgml-1)以23 mlmin-1的流速上柱,过柱完后用3倍树脂体积量(3BV,下同)的蒸馏水以34 mlmin-1的速度洗柱至洗脱液无色,再用4BV 70%的乙醇以23 mlmin-1的洗脱速度洗脱至无色透明,收集70%的乙醇洗脱液,按2.1项下方法测定总黄酮含量,计算动态吸附洗脱量,总黄酮回收率等(回收率过柱后总黄酮质量/过柱前总黄酮质量100%)。结果见表4。表4 AB-8型大孔吸附树脂对草珊瑚总黄酮的动态吸附-洗脱结果(略) 表
15、4表明,装柱量为100 g的色谱柱总黄酮回收率为96.13%,表明已吸附完全,而每克树脂吸附量为30.3mg,未达饱和。装柱量为20 g的色谱柱总黄酮回收率为60.97%,表明未吸附完全,而每克树脂吸附量为94.5 mg,吸附量已达饱和。其吸附量94.5 mgg-1(干树脂)即为AB-8型大孔吸附树脂对草珊瑚总黄酮的饱和动态吸附-洗脱量。- The paper shows that flavanones are abundant in longan nucleuses. It is significant to make full use of longan necleuses. It has
16、 a brilliant prospect in developing this natural resources.【参考文献】 1Cai Changhe, Tang Xiaolang,Zhang Aiyu, etc. longan fruit pulp nutritional therapy value and its development application prospectJ. Food Science, 2002, 23 (8): 328.2Xu Jiankai. Longan high production technology question and answerM. G
17、uangzhou: Guangdong Science and Technology Publishing Press,2001:56.3Tan Shuhui, Zhan Reting. Chinese medicine open country recognition handbook (2)M. Guangzhou: Guangdong Science and Technology Publishing Press,2004:208.4Nanjing college of pharmacy compilation group Chinese medicine study (center book) M. Nanjing:Jiangsu Peoples Publishing Press,1976:628.5Xiao Gengsheng, Huang Ruqiang,Ceng Qingxiao,etc. Nutrition composition of Longan seedsJ.Food Science and Technology,2004,(1):93.6Xia Xingzhou, Zhang Hui, Wei Chuanwan. In the banyan tree leaf the flavono
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