基于脾虚证相关基因功能鉴定的小肠上皮细胞RNA干扰转染条件研究

1、基于脾虚证相关基因功能鉴定的小肠上皮细胞RNA干扰转染条件研究         11-02-27 10:19:00     编辑：studa20                 作者：王静，李茹柳，郭文峰，徐颂芬，羊燕群，高小玲，陈蔚文 【摘要】  【目的】探索影响大鼠小肠上皮细胞(IEC6)RNA

2、干扰效率的转染条件，为进一步以RNA干扰(RNAi)技术构建不同程度表达靶蛋白的细胞模型打下基础。【方法】以24孔培养板培养IEC6细胞，利用阳离子脂质体转染FAMsiRNA片段进入IEC6细胞，采用荧光显微镜和流式细胞仪检测FAMsiRNA和转染试剂Lipofectamine 2000不同剂量比例对转染效率的影响。【结果】(1)采用荧光显微镜检测转染效率，以评分进行秩和检验，结果仅有转染试剂或仅有FAMsiRNA或两者均无的组别评分均为0，转染试剂加FAMsiRNA组别均有或强或弱的荧光表达。(2)采用流式细胞仪检测转染效率，以Lipofectamine 2000 10 L+ FAMsiRN

3、A 160 nmol/L组转染效率最高(平均763%)，而空白对照组约为1%。【结论】FAMsiRNA 160 nmol/L(20 mol/L、48 L，终体积为06 mL)+ Lipofectamine 2000 10 L组合为IEC6细胞RNA干扰时转染效率最高的转染条件。 【关键词】  基因功能;RNA干扰;细胞培养RNA干扰(RNA interference，RNAi)是真核生物中普遍存在的一种自然现象，是由双链RNA(double stranded RNA，dsRNA)启动序列特异的转录后基因沉默过程，是生物体在进化中形成的一种内在基因表达的调控机制。Fire等1首次在线虫

4、中发现RNAi现象，后来大量的研究表明，RNAi广泛存在于真菌、植物和动物中，由此人们认识到RNAi技术作为研究基因功能的一种有力的革命性工具，在功能基因组、转基因动物研究、基因治疗、药物开发等方面有着巨大的潜力2-3。目前RNA干扰技术在国内外已成为研究基因功能最常用的技术之一。影响RNA干扰效率的主要因素是小型干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)的序列及转染效率，而控制不同的干扰效率可建立模拟靶蛋白不同表达水平的细胞模型。因此，对转染条件的控制有利于获得对目的蛋白表达不同干扰程度的细胞模型。而影响转染效率的关键是转染试剂和siRNA的比例，但不同种类的细胞该

5、比例是不同的。小肠上皮细胞6(IEC6)细胞株是Quaroni等4研究建立的，其来源于新生的正常大鼠小肠，在组织学和免疫学方面具有隐窝样上皮细胞的特征，为未分化的上皮干细胞，无特异性基因表达及无致瘤性。目前将RNAi技术应用到肠上皮细胞的研究国内较少报道。本实验室近年来以IEC6细胞株用于消化系统疾病的体外相关研究5-7。为在该细胞上开展RNAi的脾气虚证相关基因的功能研究，本实验采用荧光显微镜和流式细胞仪观察转染效率的方法，优化阳离子脂质体转染siRNA进入IEC6细胞的条件，为后续实验提供参考。现报道如下。1材料与方法11细胞株IEC6细胞株(CRL1592)购自The American

6、Type Culture Collection(ATCC)，LOT：4785615。12主要试剂与仪器Dulbeccos Modified Eagle Medium(DMEM)、Fetal Bovine Serum(FBS)均为GIBCO公司产品，胰酶Trypsin(1250)为Amresco产品，乙二胺四乙酸二钠(EDTA2Na·2H2O，分子量37224)由广州威佳科技有限公司提供，Albumin及Bovine为Genebase产品，牛胰岛素(insulin)为Sigma产品，Ncontrol05815FAM(No.2005815122174)购自广州市瑞博生物科技有限公司，转染

7、试剂LipofectamineTM2000(Cat.No.11668027)、OptiMEM(Cat.No.31985062)均由Invitrogen公司提供。IX71型相差荧光倒置显微镜为Olypums公司产品，ALTRA EPICS型流式细胞仪为贝克曼尔特实验系统(苏州)有限公司广州分公司产品。13细胞培养取液氮保存的IEC6细胞37水浴使其迅速融化后，将冻存液转移至离心管内，3000 r/min离心5 min，去上清液，加入2 mL DMEM完全培养液(体积分数90%DMEM+体积分数10%胎牛血清+4 mmol/L L谷氨酰氨+01 U/mL牛胰岛素+10 mmol/L HEPES)重

8、新悬浮沉淀的细胞，接种于培养瓶，体积分数10%CO2、90%空气，饱和湿度下37°C培养，次日换液。至80%左右融合时，用25 g/L胰酶053 mmol/L EDTA消化传代。14种植细胞待培养瓶内IEC6细胞生长至80%90%时，胰酶消化细胞，制作单细胞混悬液，按1×105 cells/mL，每孔1 mL密度种植到24孔培养板上，以保证第2天生长至60%。15转染siRNA片段以定量的OptiMEM稀释Lipofectamine 2000，用加样枪轻轻混匀后，室温下孵育5 min(a液)。用定量的OptiMEM稀释FAMsiRNA，用加样枪轻轻混匀(b液)。将a液与b液

9、充分混匀，室温下孵育20 min(c液)。将c液加到合适的细胞培养板中，另外每孔加入05 mL不含血清的培养基，轻轻摇晃培养板以混匀，然后在37 、体积分数10%CO2条件下孵育细胞，5 h后更换为含体积分数10%血清的完全培养基，再放回培养箱继续培养。16荧光显微镜检测转染效率设置FAMsiRNA(A)0、40、80、160 nmol/L组，同时Lipofectamine 2000(B)设0、10、15、20 L剂量，每组3个复孔，共48孔。转染12 h后荧光倒置显微镜下成像，每孔选择3个视野，每个视野分别于明场和荧光条件下成像1张，每孔选择1张荧光表达强度最强的照片进行评分8。0分：几乎或

10、完全没有荧光。1分：有微弱荧光表达且表达不密集。3分：荧光表达强烈且密集。2分：介于1分和3分之间，有较强荧光表达但不集中或者有微弱荧光表达但较密集(图1，见彩图页第616页)。经9人次评分后计算平均分值并作数据统计，进行秩和检验。17流式细胞仪检测转染效率根据荧光显微镜成像评分结果设置不同组别，每组3个复孔。24 h内磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗细胞2次，每孔加入05 mL消化液，孵育2 min后，加入等量完全培养基终止消化，混匀，离心，弃上清，PBS重悬，计数，调整细胞至同一密度，在激发波488 nm，发射波525 nm上机检测。18统计学方法采用SPSS 110统计软件对荧光显微镜检测荧光

11、强度数据进行多样本等级资料统计分析(Kruskal Wallis H)。2结果21细胞培养IEC6细胞接种后次日开始缓慢生长，之后生长速度急剧加快。若按13分瓶传代，一般5 d后即可达80%融合。图2可见IEC6细胞由均匀的上皮样细胞群组成，呈铺路石镶嵌排列，互不重叠，呈现典型的单层形态。细胞为不规则多角形，边界清楚。细胞核较大，呈卵圆形，细胞间互相连接，呈现旺盛的增殖活性。图2相差倒置显微镜下IEC6细胞形态Figure 2Histological features of IEC6 under phasecontrast inverted microscope22荧光显微镜检测转染效率评分后

12、，若仅有转染试剂或仅有FAMsiRNA，或两者均无的组别评分均为0。而转染试剂加FAMsiRNA组别均有或强或弱的荧光表达，其中荧光表达强度最弱的是Lipofectamine 2000 10 L+ FAMsiRNA 40 nmol/L和Lipofectamine 2000 20 L+FAMsiRNA 40 nmol/L。在FAMsiRNA 160 nmol/L不变、转染试剂改变(10、15、20 L)时，3组荧光表达强度比较，差异无显著性意义(P>005)。在FAMsiRNA 80 nmol/L不变、转染试剂改变(10、15、20 L)时，3组荧光表达强度比较，差异无显著性意义(P>

13、;005)。在FAMsiRNA 40 nmol/L不变、转染试剂改变(10、15、20 L)时，3组荧光表达强度比较，差异无显著性意义(P>005)。在转染试剂10 L不变、FAMsiRNA改变(40、80、160 nmol/L)的情况下，3组荧光表达强度比较，以80 nmol/L组表达较强，差异有显著性意义(P<005)。在转染试剂15 L不变、FAMsiRNA改变(40、80、160 nmol/L)时，3组荧光表达强度比较，差异无显著性意义(P>005)。在转染试剂20 L不变、FAMsiRNA改变(40、80、160 nmol/L)时，3组荧光表达强度比较，以80 nm

14、ol/L和160 nmol/L组表达较强，差异有显著性意义(P<005)。结果见表1。23流式细胞仪检测转染效率结果见图3和表2。在无FAMsiRNA时，只有1%左右的表达率(图3-a)。转染试剂在10 L 时，表达效率要高于15 L (图3-b、c、d、e)，尤以Lipofectamine 2000 10 L+ FAMsiRNA 160 nmol/L组最高(图3-e)，平均达到763%。表1各组荧光强度评分平均秩和值表2流式细胞仪检测各组转染效率3讨论本课题组前期收集了慢性胃炎脾气虚证患者及健康志愿者各4例，镜下取胃黏膜组织，提取总RNA，一一配对制作基因芯片，采用荧光比值、生物信息学

15、、双侧t检验等方法比较分析，实时荧光定量PCR检测相关基因，结果发现差异表达基因54条，722%下调，其中与营养物质代谢和免疫调节相关差异表达基因45条，711%下调，差异基因中有4条基因为显著差异表达基因(P<005)。实时定量PCR检测差异基因5条，4条与芯片结果一致：其中核糖体蛋白S20(ribosomal protein S20，RPS20)、ACAA2(acetylcoenzyme A acyhransferase 2，脂类/脂肪酸代谢)为下调，精胺合酶(spermine synthase，SMS)、肌球蛋白(myosin，heavy chain 9，nonmuscle，MYH9)为上调。1条不符合，核糖体蛋白35(ribosomal protein L35，RPL35)在芯片为下调，在PCR为上调。研究最后获得脾气虚患者4条明确与营养物质代谢相关的基因9。为了进一步从分子水平阐述脾虚证的本质，我们拟采用RNAi