分析各类葛根中葛根素的成份

1、分析各类葛根中葛根素的成份        摘要:目的建立不同品种葛根中葛根素及总黄酮的含量测定方法。方法采用RP-HPLC法,以甲醇-水(3268)为流动相,检测波长为250 nm测葛根素含量;紫外分光光度法测柴葛、粉葛中总黄酮含量。结果葛根素峰分离度提高,峰形改善;葛根素0.2042.04 g范围内与峰面积线性关系良好(r=0.999 9),回收率为98.7%(n=5),精密度RSD=0.86%。总黄酮浓度在4.0816.32 g/ml范围内与吸收度线性关系良好(r=0.999 8)。结论该法灵敏、准确、简便易行,重复性好

2、,可用于中药葛根药材及饮片的质量控制。      关键词:葛根  葛根素  含量  分析     0 引言       葛根为豆科植物柴葛和甘葛藤的干燥根,前者习称柴葛,甘葛藤习称“粉葛”,始载于神农本草经,味甘、辛,性平,具有增加脑及冠状动脉血流量、降低血管阻力、收缩平滑肌、降血糖及解热等多种功效。民间用于治疗伤寒、温热头痛、烦热消渴等症,也是中医常用的祛风解毒药。现代研究表明,葛根含葛根异黄酮,主要为葛根素、大豆苷、大豆苷元3种活性成分,其中

3、葛根素是本属的特征成分,也是主要成分,为了对葛根进行有效的质量控制,本实验以葛根素为指标,以柴葛、粉葛药材为对象,建立了高效液相色谱法测定其葛根素的含量方法,并采用紫外分光光度法对其中的总黄酮进行了含量测定,为柴葛、粉葛的药材鉴定提供参考方法。     1 仪器与材料     1.1 仪器美国 Waters 公司600-2487高效液相色谱仪,Millenium数据处理系统;Waters2487紫外检测器;岛津UV-2401PC型紫外分光光度计;岛津AY120型万分之一电子分析天平;SB3200型超声清洗器。   

4、  1.2 材料葛根素对照品:中国药品生物制品检定所;甲醇为色谱纯;水为重蒸馏超纯水;其它试剂均为分析纯。柴葛产于安徽岳西,粉葛产于广西。     2 方法与结果     2.1 HPLC法测定葛根中葛根素的含量     2.1.1 色谱条件色谱柱:Zorbax XDB-C18(4.6mm×250mm, 5m);流动相甲醇-水(3268);流速1ml/min;检测波长250 nm;柱温22;进样体积10l。理论板数按葛根素峰计算不低于5000。在该色谱条件下,样品中的葛根素与其它峰均能

5、达到基线分离,保留时间在14.3 min左右。     2.1.2 对照品溶液的制备精密称取葛根素对照品5.1mg,甲醇定容于25ml量瓶。分别移取0.5,1.0,2.0,2.5ml于5ml量瓶,水定容,与原液共同作为HPLC用对照品溶液。     2.1.3 供试品溶液的制备 热回流提取法:精密称取柴葛、粉葛粉末(过50目筛)各0.1g,置具塞锥形瓶中,精密加入30%乙醇50 ml,称重。回流提取30min,放冷,称重并以30%乙醇补足减失重量,摇匀过滤,取续滤液为供试品,待测。     索氏提取法:称

6、取柴葛、粉葛粉末各0.5g, 精密称定,以甲醇为提取剂提取4h,过滤,浓缩提取液并用甲醇定容于10ml量瓶。超声处理30min,取上清液以水定容于10ml量瓶,待测。     2.1.4 线性关系考察取对照品溶液,按照色谱条件进样10l,葛根素进样量X(g)为横坐标,以峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线,其回归方程为:Y=3.5076×106X+3.2745×104,r=0.9999。结果表明,葛根素进样量在0.2042.04g范围内与峰面积线性关系良好,可用外标两点法计算含量。     2.1.5 精密度考察在色谱条件

7、下,吸取同一对照品溶液10 l,连续进样5次,测得峰面积,RSD=0.8%,表明进样与峰面积积分的精密度良好。     2.1.6 重复性考察取同一批柴葛、粉葛样品5份,按外标法计算含量,RSD=2.8%,表明分析方法重复性良好。     2.1.7 稳定性考察精密吸取对照品溶液10l,分别在0,1,2,4,8,12,24,48h时进样,在色谱条件下测定峰面积,其RSD值为1.4%。表明葛根素在室内正常条件下48h内稳定,因此整个实验过程可以在常温不避光的条件下操作。     2.1.8 回收率考察精密称

8、取已知葛根素含量的同一样品药材粉末5份,20mg/份,精密称定后,每份加入浓度为0.204mg/ml的对照品溶液2.53.3 ml,按“供试品溶液制备”项下操作,精密吸取10 l,进样,计算回收率。     2.1.9 样品测定按“供试品溶液制备”项下操作,制备各样品溶液,精密吸取10l,进样,在所选色谱条件下测定,外标两点法计算含量。     2.2 紫外分光光度法测定葛根中总黄酮含量     2.2.1 线性关系考察精密称取葛根素对照品5.1mg,甲醇定容于25ml量瓶。移取0.2,0.4,0.5,0

9、.6,0.8ml置于10ml量瓶,水定容,为紫外测总黄酮用对照品溶液。     以溶液浓度为横坐标,吸收度为纵坐标,得线性方程:Y= 0.078X+0.0152,r=0.9998。表明总黄酮浓度在4.0816.32g/ml范围时与吸收度线性关系良好。     2.2.2 供试品制备 方法1:分别称取柴葛、粉葛4.5g,置于圆底烧瓶,乙醇回流提取3次,40ml/次,时间均为1h。合并3次滤液并浓缩置25ml量瓶,乙醇定容。取1ml用乙醇定容于100量瓶,再取1ml上清液于10ml量瓶,水定容,待测。以1ml乙醇加水定容于10ml量瓶中为

10、空白对照。     方法2:取上述液相用索氏提取法制得的待测品0.4ml,置于10ml量瓶,水定容,待测。     2.2.3 吸收波长考察与样品测定在200800nm间紫外扫描浓度为8.16g/ml的葛根素对照品溶液。在249251nm处有最大吸收,选用250nm测定。分别测定两种方法制得4个样品。     3 讨论     HPLC法对不同产地的柴葛、粉葛中的葛根素的含量进行了测定,表明柴葛中葛根素含量约为粉葛的3倍,紫外测总黄酮含量表明,柴葛中葛根素量占总黄酮量的55%

11、左右,粉葛中葛根素量占其总黄酮量的48%左右。同时比较了不同提取方法对葛根素和总黄酮含量测定的影响,发现回流提取法得到的葛根素含量较高,更有利于其提取。     在葛根素的提取中使用体积分数为30%的乙醇,是通过实验与参阅文献得出的结果。此时总黄酮中的酚羟基主要以离子形式存在,HPLC色谱图为单峰,而使用60%乙醇提取时,总黄酮中酚羟基以离子与分子形式共存,色谱图为双峰。     葛根素HPLC图谱中葛根素峰易拖尾,分离度低,本文研究了甲醇:水不同配比对峰形、分离度和保留时间的影响,体积比为2575时葛根素峰拖尾,与后面的小峰分离度为1.3,体积比为3565时葛根素峰与前峰易重合。甲醇水比(V/V)为3268时,在样品分析中葛根素与其它峰均能达到基线分离,保留时间适中,柱效高,故选用为流动相。