人端粒重复序列结合因子cDNA全长克隆及在大肠杆菌中的高效表达

1、    人端粒重复序列结合因子cDNA全长克隆及 在大肠杆菌中的高效表达        端粒和端粒酶表达以及调控研究是当前国际上关于肿瘤和白血病发生、发展机理研究中非常活跃的领域。人端粒重复序列结合因子(hTRF1)是 1995年新发现的DNA结合蛋白,在人端粒重复序列稳定性及端粒酶活性中起重要调节作用1。但是其中的机制还不清楚。迄今尚未见抗hTRF1单克隆抗体的报道，也未见hTRF1与白血病和其他恶性肿瘤相互关系的报道。我们克隆并表达hTRF1，旨在制备抗hTRF

2、1特异性抗体，以进一步研究hTRF1作用机理和hTRF1与恶性肿瘤的发生、发展的相互关系。一、材料与方法1.引物设计：根据人TRF1cDNA全长序列2，选择其编码区序列的5端和3端为起始端，设计长度为32 bp的引物并分别引入KpnI、EcoRI酶切位点，扩增片段长度为1.4 kb。引物序列如下：上游引物：5-CG GGTACCTTAACATGGCGGA-GGATGTTTCCT-3 KpnI；下游引物：5-CCG GAATTCAATAC-TTAACTGTCCTTTCATCAA-3 EcoRI2.扁桃腺组织总RNA抽提及RT- PCR扩增TRF1cDNA；PCR产物胶上回收、纯化和pCR-TOP

3、O-TRF1的建立，均按分子克隆实验指南3进行。3.重组表达质粒的构建及鉴定：以Kpn和EcoRI酶切pET29a和pCR-TOPO-TRF1，电泳后胶上回收pET29a和TRF1cDNA片段，连接后转化DH5，筛选重组子pET29a-TRF1，以酶切谱和DNA序列测定鉴定插入片段。4.蛋白高表达菌株及最佳诱导时间的筛选：以pET29a-TRF1转化大肠杆菌BL21(DE3)PlysS，加入IPTG终浓度为1 mmol/L诱导蛋白表达，分别于1，2，3，4 h各取1 ml菌液，离心收集细菌，加100 l PBS 超声粉碎，经Follin-酚法蛋白定量，每泳道40 g上样，10% SDS-PAG

4、E电泳。考马斯亮蓝染色，脱色后干胶。5.蛋白质的大量诱导表达、细菌蛋白提取及诱导蛋白含量测定： 在250 ml的锥形瓶中加入100 ml LB培养基，IPTG诱导2.5 h后收集细菌，每泳道40 g总蛋白电泳，考马斯亮蓝染色，脱色后干胶，激光光密度扫描，计算诱导蛋白占细菌总蛋白的百分比。6.表达蛋白的纯化：以超声法粉碎经诱导表达的大肠杆菌，经高速离心后上清液含可溶性蛋白，沉淀菌体以含6 mol/L尿素的洗脱液置冰浴中1 h，上清液为不可溶蛋白。上清液以S-蛋白琼脂糖结合30 min，然后以洗脱液洗涤3次（不可溶蛋白部分用含2 mol/L尿素的洗脱液）。以2 mol/L胍乙锭洗脱液解离纯化蛋白，

5、离心后上清液依据来源可分为可溶部分纯化蛋白及不可溶部分纯化蛋白。7.免疫印迹鉴定诱导蛋白：以人扁桃腺组织提取的总蛋白为阳性对照，每个泳道加1 g纯化的融合蛋白，经10%的SDS-PAGE电泳，转膜，把膜置1200稀释的371号抗体中4反应过夜。以加强化学发光法显示特异条带，X线胶片感光、显影、定影。二、结果1.TRF1 cDNA的扩增：扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳，可见1 400 bp左右的DNA条带。2.重组表达质粒pET29a-TRF1的鉴定：以Kpn、EcoRI酶切证实重组质粒为pET29a-TRF1，DNA序列测定结果显示与原始的TRF1cDNA相应序列一致。3.诱导蛋白的SDS-

6、PAGE电泳：IPTG诱导1，2，3，4 h后，细菌蛋白电泳结果表明在分子量约30 000处比含pET29a的阴性对照多出一条蛋白带。诱导1 h即可见蛋白表达，2 h时增加，3，4 h的蛋白量与2 h相比增加不明显。故选定2.5 h为最佳诱导时间。4.诱导蛋白含量测定：激光光密度扫描显示，诱导蛋白占细菌总蛋白的18.6%。5.融合蛋白的纯化：以S-protein纯化试剂盒纯化TRF1融合蛋白，第1，2次洗脱液中（可溶和不可溶部分）均可在30 000处见特异性条带，以可溶部分洗脱液为主。三、讨论hTRF1是端粒酶活性的负调控蛋白，全长为439个氨基酸。羧基端与Myb 原癌基因DNA结合区同源，具

7、有HTH (helix-turn-helix) 结构，是与DNA结合的功能区（Myb区）。蛋白质的中间约包含200个氨基酸为TRF1特异保守区。2个hTRF1形成同源二聚体, 以2个Myb区和人端粒的TTAGGG重复序列结合，调节端粒酶活性。在研究中，以RT-PCR方法从人扁桃腺组织中获得cDNA 1.4 kb全长片断，将其克隆到PCRII-TOPO质粒，然后再克隆到表达载体pET29a，每一步均以DNA测序、酶切谱鉴定片断的准确性。进一步将重组质粒pET29a-TRF1转化至大肠杆菌BL21（DE3）PlysS中，经异丙基-D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导融合蛋白的表达。并以pET29a-TR

8、F1融合蛋白含有S-蛋白多肽的特点，应用S-Tag纯化系统分离纯化TRF1融合蛋白。研究结果表明，转化了pET29a-TRF1的大肠杆菌BL-21（DE3）PlysS可以高效表达TRF1融合蛋白，占菌体总蛋白含量的18.6%，以Titia de lang博士惠赠的抗hTRF1多克隆抗体371号进行融合蛋白免疫印迹试验，证实所表达的融合蛋白具有hTRF1抗原性。在实验中发现不论IPTG诱导表达的融合蛋白，还是经S-Tag系统纯化后的融合蛋白分子量均在30 000左右，而完整的蛋白分子量应为60 000。我们曾以质粒稳定试验（plasmid stability test）证实携有TRF1- pET

9、29a的大肠杆菌BL-21（DE3）PlysS是稳定的，并检验IPTG诱导时间以及培养温度对蛋白表达并无明显影响。可能是由于插入片断太长，DNA的二级结构不利于转录表达，所表达的蛋白不稳定等因素而影响hTRF1全长蛋白的表达。但是其表达和纯化的蛋白经多抗证实具有hTRF1抗原性，可用来进一步制备抗人TRF1单克隆抗体，所获得的重组质粒及纯化蛋白，将有利于hTRF1作用机理和hTRF1与恶性肿瘤发生、发展关系的研究。 基金项目：国家自然科学基金资助项目（39870339）黄河（310003 杭州，浙江医科大学附属第一医院血液科）R Parwaresh（德国基尔大学血液病理所）U Kellner（德国基尔大学血液病理所）陈巧芳（310003 杭州，浙江医科大学附属第一医院血液科）参考文献1，Chong L, Steensel BV，Broccoli D, et al. A human telomeric protein. Science, 1995, 270:1663-1666.2，Steensel BV, Lange TD. Control of telomere length by the huma