即时检验与胶体金免疫层析法技术

1、在刚刚过去的半个世纪里，大多数的免疫检测需要昂贵分析设备和仪器，并且要专业人员操作检测。虽然这些昂贵的检测方法具有很高的灵敏度和特异性，但却因为昂贵、不方便携带、专业性等原因，而无法满足人们健康保障的日常需求。胶体金免疫层析诊断技术是根据免疫反应原理、利用大孔径微孔滤膜为载体、以胶体金做为固相标记物，来定性、半定量或定量检测样本中待测物质的一种胶体金快速免疫分析技术。        胶体金免疫层析法即时检验技术（或称“侧流免疫层析技术”和“免疫胶体金技术”等）是20世纪九十年代以来在单克隆抗体技术、免疫层析技术及胶体金显色技

2、术基础上发展起来的一项新型体外诊断技术。近年来发展迅速，目前已经在农业、畜牧业、环境检测、尤其是在家庭自检领域得到了广泛应用。胶体金免疫层析诊断试剂已经成为近年来生物产业化最成功的产品之一。 一、即时检验与胶体金免疫层析法技术展望        随着社会的发展，生活水平的提高，人们要求社会保健机构能提供包括实验室检验在内的一系列更加完善的服务。要了解病人的身体状况和病情以确定治疗方案通常需要尽快获得检验结果，从而使病人尽早得到治疗。在某些情况下，传统的中心实验室（Lab Center ）满足不了人们这种需求。 19

3、95 年3月，美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）发表了 AST2-P 文件，即患者床边体外诊断（POCT）检验导则。床边体外诊断是利用便携式设备和试剂在数分钟内得出检验结果的一种检验方式，广泛适用于医院、护理病房、救护单位、保险公司、家庭保健网络等领域，它的出现使传统上由专门检验人员完成的工作更多地交给了非检验人员完成。这是一种快速的检验方式，可以满足人们在时间上的要求，适应现代社会发展的需要。 POCT 不仅具有快速得出结果、操作简单、容易使用和小型化等特点，而且又无需传统的医院实验场地和设备。这使得私人诊所或不具备条件的社会医疗机构也能快速正确地得到诊断。最具魅力的是，很多家庭疾病自

4、检（Homelab ）产品（最主要的是一步法快检类产品）也陆续出现，这使得患者在自己家中就可以独立完成一些疾病的检测操作。使用"一步法"快检类家庭自检产品，自我检测疾病和监视健康状况，是未来即时检验领域的发展趋势。图1. 胶体金免疫层析法即时检验产品结构拆分图生物诊断技术必然向着更方便、更灵敏、更准确的方向迈进， 即时检验技术的兴起也必然会给就诊方式和医疗行为带来革命。免疫分析技术也同时会向两个方向发展：一类为全自动化的免疫分析；另一类为以硝酸纤维膜为载体的 POCT 快速免疫分析。前者需要价格昂贵的全自动仪器及与 仪器严格配套的各种试剂盒，目前只能在医疗及检测中心应用，虽

5、也能较快速给出结果，但仍需一定时间，不适合远离医疗及检测中心的地区，更不能用于“患者床边检验”、家庭疾病自检 （Homelab） 及流动或广泛的普查之用。随着即时临床诊断及即时临床决策和普查的需要，以硝酸纤维素膜为载体的快速诊断方法迅速和广泛的发展起来。其中九十年代兴起的“一步法”快检技术（ONE-STEP）发展最为迅速，应用也最为广泛。免疫检测技术将被日益广泛地应用于以医疗健康为主的领域以及拓展至非医疗领域（比如食品卫生与安全、动物防疫与检疫等）进而形成独立的POCT快检行业 。 上海派坤生物工程有限公司及时抓住这一世界诊断科技发展的最新动向，着重发展了以基因工程抗原/抗体、单克隆抗体、多肽

6、合成抗原、胶体金标记为核心的免疫法 即时检验技术平台，适时的推出了服务于家庭为主的 居家健康自我检测产品 （Homelab） 体系。 目前派坤生物家庭自检产品的使用类别除了疾病的家庭自检以外，也已涵盖居家健康自检，如亚健康检测、营养保健监测、食品卫生与安全监测、化妆品卫生与安全监测、宠物及家居植物疾病诊断、室内（车内）环境监测、水质监测、药物滥用监控、出行安全监控等预防保健应用领域。.二、派坤生物即时检验技术背景       派坤生物公司（Bioengine）联合天津大学生命科学与工程研究院率先在中国建立起产品门类齐全的胶体金免疫层析

7、诊断技术的研发、生产基地以及带领业内同行共同搭建起胶体金快检技术咨询平台:天津大学-派坤生物联合实验室,为国内有望介入该领域的生物和医药公司提供政策咨询、行业分析和技术输出等CRO相关服务，并提供自制的胶体金相关设备、材料、试剂以及参与国内胶体金新兴应用领域的项目合作。        派坤生物公司聘请了强大的技术智囊团和公司顾问团，他们均为国内知名的诊断试剂行业专家，天津大学的教授，或海外留学人员，以及国内外诊断试剂公司高级技术人员和管理人员。派坤生物公司的发展模式可概括为以下两点：   

8、60;    1、天津大学技术研究与生产合作中心（MRC）模式        派坤生物公司采取与技术互补或生产优势的国内企业或科研单位共建技术研究与生产合作中心（MRC）的方式进入产业领域。公司利用自身的科研渠道优势定期安排员工或天津大学MRC 的研究生到国内、外研究机构进行技术交流、工作培训，或邀请各方学者到公司讲学，并举办学术讨论会。此外，派坤生物公司美国和加拿大分支机构还从事国际间科技项目合作和国际贸易项目咨询、代理的业务。     

9、60;  2、CRO发展模式         天津大学生命科学与工程研究院通过自身不断发展的委托研发服务体系（Contract Research Organization, CRO）协助生物公司及医疗器械公司设计、经营或管理临床试验。协助国内企业将自己的产品打入FDA 国际市场体系，同时代理多家国外著名家庭自检（Homelab ）品牌产品，将最优质的产品引入中国，以促进国内家庭预防医学体系的完善以及医疗器械体外诊断行业的发展。         我

10、们的实践还表明：在国外设立研发中心或者直接引进国外胶体金免疫层析技术以提高企业的研发能力和稳定原料供应，在国内设立生产基地以利用相对较低的人力资源是国内企业比较可行的发展途径。        在国内的市场需求推动下，在动物检疫与防疫，食品卫生与安全等领域，即时检测技术也展示了广阔的应用空间，比如高致病性禽流感检测，牛奶抗生素残留检测，猪肉瘦肉精检测等等。派坤生物希望在中国不断优化升级的产业政策推动下，逐步加大和其他检测应用领域的公司、科研单位和健康服务机构的项目合作和技术交流，共同将胶体金一步法快速检测技术的即时检测内涵不断

11、扩充和完善。.派坤生物技术平台基础派坤生物联合天津大学生命科学与工程研究院即时检验中心（POCT Service Center of Tianjin University）共同开展基因工程抗原抗体、多肽合成抗原、单克隆抗体、胶体金一步法快检、蛋白质芯片、亲和层析、磁分离等方向的基础研究 ，其天津大学-派坤生物联合实验室检测应用领域的科研方法主要采取电化学库伦阵列检测器-HPLC仪器检测与 胶体金一步法快检试纸快速检测相互对照和联合的方式，共同形成临床、食品安全等检测项目的完备解决方案。        派坤生物与美国圣地亚哥B

12、IOMED 纳米技术实验室建立起长期的项目合作和委托生产（OEM）关系，主要针对美国市场上成熟的胶体金一步法快检系列产品进行技术工艺配方 、抗原、抗体原料和成品、半成品的引进， 通过人员互派、技术互换、联合研发等方式的不断交流和合作、共同形成了天津大学现有的胶体金快检研发基础平台。这种国际间合作无疑加快了派坤生物疾病检测、药物滥用监测、法医鉴定、动植物疾病诊断等类别的 POCT/Homelab 产品的国产化研发进程。技术研究和生产合作中心（MRC）派坤生物目前构建的两个技术研究和生产合作中心 （MRC） 中，天津大学 MRC 侧重于在临床即时检测、蛋白质芯片、基因诊断等领域跟踪世界最先进水平的

13、技术，并进行食品安全领域高精尖仪器检测配合免疫层析试纸条研发的应用研究；以及 美国胶体金一步法快检类产品线的引进和吸收，经过国内设备和工艺改造在GMP实验环境下进行中试放大，生产出可供国内企业和科研院所直接应用的大板。其技术优势主要体现在以下方面：1 适合国情的胶体金一步法快检产品生产工艺、配方、设备；2 基因工程、生物分离、多肽合成 、单克隆抗体、小分子蛋白偶联、亲和层析、磁分离等其他已有技术基础；3 率先在国内引进了国际领先的电化学库伦阵列检测器-HPLC仪器检测系统，使天津大学 MRC 在疾病诊断、食品安全、食物营养、毒品检测、中药指纹图谱等检测领域具备了国际领先的设备优势。 

14、       此外，美国圣地亚哥 MRC 侧重于临床体外诊断（IVD）方向胶体金标记、乳胶标记等免疫层析类产品工艺配方的研究，并且严格按照国际标准进行"一步法"快检类家庭自检（Homelab）产品的外协生产。天津大学MRC则根据国内的新情况进行食品安全、动植物疾病诊断等方向的小试和中试研究。        两个中心配备的主要技术和生产人员很多都在天津大学生命科学与工程研究院学习深造过，具备较高的学历和技术素养，并经过派坤生物严格的公司技术训练，保

15、证了派坤生物快检技术的长足进步以及产品的一路领先。        在国内即时检验技术产业合作联盟基础之上，经过各合作方的共同努力，派坤生物CRO体系对国内即时检验产业的科研贡献以及推动作用主要表现在以下三个方面：.1、胶体金一步法快检产品快速研发平台的建立        已经成熟的掌握了单克隆抗体制备技术和小分子蛋白偶联技术并建立了胶体金标记胶体金一步法快检产品快速研发平台；完善了用于胶体金类产品研发的关键原料抗原/抗体的快速筛选方案；筛选和专门定制了适合

16、国内生产一步法快检试剂盒的玻璃纤维膜，聚酯膜，硝酸纤维素膜，吸水纸，塑料外壳，塑料底板（片材）等专用耗材，形成了派坤质量体系下的原材料标准和产品设计和组装规格、半成品和成品质量标准等，建立了完备的国内、国外半成品（大板）供应体系。2、稳定的胶体金类产品研发标准配方工艺         天津大学MRC师生团队通过派坤生物不断的科研项目推进，必要的翻译和整理了大量的美国 MRC 技术文献资料、培养了国内众多的快检专业人才、并组织撰写了一步法新产品研究实验过程工艺的标准研发操作规程（SOP），将样品垫、金标垫、硝酸纤维素点膜的配方

17、和工艺优化，并固定化以及形成模块化。        一步法快速检测试剂盒制备所需的玻璃纤维膜，聚酯膜，硝酸纤维素膜，吸水纸，塑料外壳，塑料底板（片材）等专用耗材标准化等研发思想和操作实践经验的形成和完善将极大地降低新产品研发的诸多不确定性，为一步法快速研发平台的建立提供了便利条件 ，因而可根据国内市场的需要快速研发出一系列新产品。 3、适合中国国情的胶体金类快检产品生产线设备        天津大学 MRC 已研制成功的连续生产型点膜仪（通用型）

18、是用于胶体金一步法快检试剂盒等领域的生产型设备，能连续地把reagent均一地分布在硝酸纤维素膜上，在生产效率上大大地高于实验室用设备，机器配置两套高精度生化泵、相应点膜管线及点膜头（均美国进口），可同时点C、T线，不会划伤膜。该机器的使用只需要引入220CAV/1KVA的电源即可，整机触摸屏操作，全中文提示，操作简单，经过大规模生产型企业的考验，性能非常稳定。        点膜机和切条机是一步法快检试剂盒的研发和生产的两种必备的设备，喷金标机则根据金标垫制备工艺不同作为可选设备；国外设备用于 快检产品生产的一般为全自动化

19、连续生产，不需太多人员操作，但此类设备极其昂贵，而且对耗材提出更苛刻的标准化要求，生产成本很高，不适合中国国情，派坤生物-天津大学 MRC 将在已研制成功的通用型点膜机的基础上进一步研发适合中国生产实际需要的多型号连续型点膜机，不断填补国内该产业专业设备方面的空白。 .三、 派坤学苑与胶体金免疫层析法即时检验技术推广胶体金免疫层析法即时检验技术的优势        1971年Faulk 和Taytor将胶体金引人免疫化学，此后免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法，在生物医学各领域得到了日益广泛的应用。免疫胶体金技术是四大免疫

20、标记技术之一，问世三十多年来发展十分迅速，在生物医学各研究领域特别是在医学检验中得到了日益广泛的应用。目前在医学 和保健检测中的应用主要是被通俗的称为“一步法”的侧流免疫层析技术（immunochromatogra-phy）和免疫渗滤技术 （Dot-immuogold filtration assay DIGFA），此外，还有基于胶体金等标记及硝酸纤维素膜的蛋白质芯片技术。        下图为以 胶体金免疫层析法进行单项检测和多指标联合检测的产品的实物图（左图分别为检测试纸条，检测卡，检测笔；右图为五项联检卡）： 

21、;                        免疫层析法 （Immunochromatography）即时检验技术是九十年代在美国兴起的一种基于免疫胶体金技术的快速 检测技术， 临床上应用的产品主要采用双抗体夹心的设计，其原理是：样品中如果含有抗原，其首先在加样垫下与胶体金颗粒标记的单克隆抗体（鼠源）结合，形成抗原-抗体*胶体金复合物，并靠毛细作用向检测线移动。在检测板的硝酸纤维薄膜的检测线上固定有另一

22、单克隆抗体。当样品处理液层析至检测线时，可以进一步形成抗体-抗原-抗体*胶体金夹心复合物，并在检测线上聚积显现出一条可见的红线。无此红线则表示样品中无抗原存在。从加样垫中泳动过来的胶体金标记的单克隆抗体是鼠源性的，无论携带抗原与否，均可被固定于对照线处的羊抗鼠抗体所捕获，形成红色的线条，这表示加样量充足及液体流动正常。        目前在美国以POCT临床检验新模式为背景以及 胶体金免疫层析法即时检验技术为基础已经形成一个独立的POCT快检产业，该产业在美国圣地亚哥已经形成相当的产业规模。·癌胚抗原（CEA）一步

23、法快速检测原理图：·癌胚抗原（CEA）一步法快速检测试剂结构图：            上图为癌胚抗原（CEA）一步法快检试剂条的结构功能区图。        胶体金免疫层析法即时检验技术与以往的任何一项检测技术相比的突出优点，除了快速（全部检测过程仅需 3-20分钟）以外，还包括：        ·准确：采用单克隆抗体技术，使产品的灵敏

24、性和特异性都非常好。        ·简便：不需其它任何仪器设备，操作也极其简单，可随时随地进行。        ·价格低廉：人员，场地，仪器，管理成本等方面的节省使进行该项检测的医疗整体成本比较低。        ·人为操作误差小：由于全部操作过程只有“加样”一步，所以操作所带来的误差非常小。     &#

25、160;  ·可单人份检测：对标本既能成批检测，又可单份检测，患者可立刻拿到结果，不必等待。        ·可进行联检：该层析法为通过硝酸纤维素膜进行横向流动，允许并联多个试剂条进行多项指标联合检测。        ·稳定性好：金标试剂稳定，不用冰箱条件，可长期保存（一般为两年）。        ·检测标本种类多：既可用于查血，又可用于检尿或唾液，因而适合各种人群和场合的普查。        目前该技术已经在国外的临床医学检验中得到广泛应用，由于该免疫技术形成的产品使用起来非常简单，并且在正确操作的前提下检测结果甚至可以同医院