粉防己碱诱导宫颈癌细胞凋亡的定性定量研究

1、粉防己碱诱导宫颈癌细胞凋亡的定性定量研究         11-01-06 11:47:00     编辑：studa20              作者：朱克修，李玢，邓卓，袁彩萍，慕建宁，韩晓兵【摘要】  目的 从定性定量角度探讨粉防己碱诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡的作用。方法 采用MTT法检测不同浓度粉防己碱作用不同时间对人宫颈癌He

2、La细胞株的增殖抑制作用。通过流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测细胞凋亡情况。结果 粉防己碱对宫颈癌HeLa细胞具有增殖抑制作用，且呈时间、浓度依赖性。应用流式细胞仪检测到15mol/L粉防己碱诱导HeLa细胞产生的凋亡率为(51.8±0.97)%，显著高于对照组凋亡率(24.3±1.23)%(P<0.05)。通过激光共聚焦显微镜观察，与对照组比较，粉防己碱作用后HeLa细胞具有明显的凋亡形态。结论 粉防己碱能够抑制HeLa细胞的增殖并诱导其凋亡。 【关键词】  粉防己碱；宫颈癌；凋亡；      &

3、#160;  ChinaABSTRACT: Objective  To study the effects of tetrandrine on apoptosis of HeLa cervical cancer cells qualitatively and quantitatively. Methods  We measured tetrandrine-induced inhibition of HeLa cell proliferation at different concentrations and time points by MTT assa

4、y. The rate of Hela cell apoptosis induced by tetrandrine was detected by flow cytometer and confocal laser scanning microscope (CLSM). Results  Tetrandrine inhibited the proliferation of HeLa cells in dosage- and time-dependent manners. Flow cytometry showed that the apoptosis rate was (51.8&#

5、177;0.97)% at the concentration of 15mol/L, which was significantly higher than that in the control group (24.3±1.23)% (P<0.05). The cells treated with tetrandrine showed typical apoptotic morphology under CLSM. Conclusion  Tetrandrine can inhibit proliferation and induce apoptosis of H

6、eLa cervical cancer cells.KEY WORDS: tetrandrine; cervical cancer; apoptosis全球每年估计约有470000例新增的宫颈癌病例，并且每年约有230000例宫颈癌患者死亡。发展中国家占80%，在发展中国家的很多地区，宫颈癌是最常见的肿瘤1-2。早期宫颈癌的治疗主要是通过手术，进展期的宫颈癌主要通过体外放射线和体腔内放射线治疗。近年来有很多关于放、化疗结合的研究。但是，放疗和化疗以及放、化疗均有明显的副作用，所以能否利用一些毒副作用较小的药物来治疗宫颈癌是一个值得研究的问题。    粉防己碱(te

7、trandrine, Tet)是从中草药防己的根块中提取的双苄基异喹啉类生物碱，具有广泛的药理作用，临床用于治疗关节炎、高血压、心率失常和肺纤维化等疾病具有较好的疗效3-8。许多研究认为粉防己碱是一种有前途的抗癌药物，可以抑制多种肿瘤细胞的生长9-14。然而，粉防己碱对宫颈癌细胞是否具有抑制增殖的作用尚未见报道。本实验以宫颈癌HeLa细胞为处理对象，以不同剂量的粉防己碱处理，观察其诱导HeLa细胞凋亡的作用，为抗宫颈癌药物治疗提供新的思路。1  材料与方法1.1  主要试剂 RPMI1640培养基购自GIBCO公司，粉防己碱(Tet)购自上海友思生物技术有限公司，

8、根据文献7以双蒸水稀释粉防己碱，配置浓度为0.1mmol/L的粉防己碱储存液(0.1mol/L HCl助溶，0.1mol/L NaOH调整pH值至6.66.7)，4保存，四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自Amresco公司，Annexin-FITC凋亡检测试剂盒购自美国Bipec公司，胰蛋白酶，二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma公司。1.2  细胞株和细胞培养 宫颈癌HeLa细胞株由西安交通大学临床医学研究分子中心提供。常规培养在含100mL/L胎牛血清的RPMI-1640培养基中，培养条件为37，50mL/L CO2饱和湿度，待细胞长至80%融合时，2.5g/L胰酶消化传代，

9、取对数生长期细胞进行实验。1.3  MTT法检测宫颈癌HeLa细胞的增殖抑制率 取对数生长期的HeLa细胞，调整细胞浓度5×104个/mL，以200L/孔接种于96孔板，37，50mL/L CO2培养箱中培养24h，以粉防己碱终浓度为10、12.5、15、17.5、20、30mol/L处理细胞。每个浓度设三个平行孔，并同时设阴性对照和空白对照，分别于作用24、48、72h后每孔加入50mg/L的MTT溶液20L，37孵育4h后，终止培养，小心吸去上清，每孔加入150L DMSO，振荡器震荡10min，使结晶溶解完全，用酶标仪在490nm处测量A值，按以下公式计算细

10、胞增殖抑制率：抑制率(%)=(1-A实验组/A对照组)×100%。1.4  实验分组 实验分为对照组和处理组。对照组即正常生长的HeLa细胞；处理组即给予粉防己碱处理的Hela细胞。1.5  AnnexinV/PI双染法流式细胞数检测细胞凋亡 以0mol/L，15mol/L粉防己碱处理细胞24h后，收集细胞，调整细胞浓度为1×106个/mL。取1mL细胞，2000r/min，4，离心10min，弃上清。用预冷的PBS洗涤细胞，400L 1×Binding Buffer重悬细胞，密度为1×106个/mL。加5L An

11、nexinV-FITC，轻柔混匀，在48避光孵育15min。再加10L PI，在48避光孵育5min。于1h内上流式细胞仪检测。1.6  AnnexinV/PI双染法激光共聚焦显微镜观察细胞的形态学变化 将对数生长期HeLa细胞以1×105个/mL接种于预先置有盖玻片的无菌6孔板中，终体积为2.5mL。待24h贴壁后，加入粉防己碱，使其在培养基中终浓度为15mol/L，同时设不加药的对照组。作用24h后，按AnnexinV-PI细胞凋亡试剂盒步骤染色，封片后立即用激光共聚焦扫描显微镜观察细胞并拍照。结果判定：正常活细胞AnnexinV和PI均为低染；凋亡早期的细胞

12、膜完整，AnnexinV高染呈绿色，PI为低染；凋亡中晚期细胞则AnnexinV和PI均为高染，细胞膜呈绿色，细胞核呈红色。1.7  统计学处理 实验均重复3遍，实验结果用均数±标准差(±s)表示，并用SPSS13.0软件对实验结果进行分析。MTT法试验结果用两因素方差分析检验，其余试验结果进行两独立样本均数的t检验。P<0.05为差异有统计学意义。2  结    果2.1  粉防己碱对宫颈癌HeLa细胞具有增殖抑制作用 MTT实验结果显示，当粉防己碱的浓度在10mol/L以上时，对HeLa细胞的生长具有抑制作用，且随着浓度和时间的增加，抑制率逐渐增高，具有时间、浓度依赖性。随着浓度的增加，作用24h后，抑制率增加明显，24h IC50为17mol/L。而作用