射频能量在治疗关节软骨退变中对软骨细胞及基质的影响

1、射频能量在治疗关节软骨退变中对软骨细胞及基质的影响                作者：孙建华刘维钢史晨辉王永明 董金波李宽新何斌【关键词】  细胞死亡   摘要：目的实验研究射频消融能量大小与关节软骨细胞及基质损伤效应之间的关系。方法建立牛膝关节软骨退变模型，模拟膝关节镜环境，射频消融气化仪在15、40、70 W的不同能量设置条件下，处理牛膝关节退变软骨1 min，同时设置对照组，共分4组，每组6份标本，随后行软骨组织块培养

2、，HE染色，FDAPI双荧光染色，GAG释出率。结果随着射频消融能量的增加，空泡率明显增加，软骨细胞死亡率明显增加，GAG释出率明显减少。结论随着射频消融输出能量的增加，软骨细胞死亡率明显增加，软骨基质损伤明显加重，射频消融能量大小与关节软骨细胞及基质的损伤呈正相关关系。关键词：射频消融；细胞死亡； 细胞外基质Effects of radiofrequency energy on degenerative articularAbstract：ObjectiveTo study the effect of radiofrequency energy on chondrocytes and mat

3、rix of traumatic degenerative articular cartilageMethodTraumatic degenerative arthritis models were established in 24 bovine knees,which were divided into 4 groups:15w group (A),40w group(B)70w group (C) and control group untreated(D)After the degenerative cartilages of group A,B,C were treated resp

4、ectively for 1 min with 15w,40w,70w radiofrequency energy,the cartilage blocks were cultured and examined with HE stain and FDA (flurescein diacetate) /PI (propidium iodide) double fluorescent stain,and GAG (glucosamineglucan) release rate was measuredResultFollowed the enhance of radiofrequency ene

5、rgy strength,the vacuolization rate and mortality rate of cartilage cells were correspondently increased (P005),but GAG release rate was decreased (P005)ConclusionThe results shows that there are positive correlation between the strength of radiofrequency energy and degree of matrix damage as well a

6、s mortality of cartilage cellsKey words：Radiofrequency energy；  Degenerative cartilage； Arthritic knee射频技术在关节软骨成形术中的应用日益广泛。但由于关节软骨缺乏神经、血管及淋巴系统，受损后自身修复能力有限，而射频治疗产生的热量可能对软骨细胞及基质有损伤效应1。因此射频能量在软骨成形术中的安全性目前逐步受到重视。作者在模拟关节镜环境下，对比研究不同射频消融能量对正常软骨细胞的即时损伤，报道如下。1  材料与方法11   标本及分组111  关节

7、软骨退变模型制作及设备准备当地屠宰场得到新鲜完整的牛膝关节6副，无菌条件下暴露股骨髁部关节软骨面，刀片轻轻刮除表面软骨膜，骨锉锉光关节软骨表面，制作级软骨退变模型。射频消融设备是SERFAS双极射频气化仪(Stryker公司)，消融电极型号为278500350。112 标本分组及参数设定射频消融对象以单元格为单位，每幅牛膝关节软骨选择4个单元格(1 cm×1 cm)。参数设定选择CUT1、CUT3、CUT5，相对应输出能量为15、40、70 W，其中选3个单元格分别用相应射频消融能量处理1 min，另一组未经射频消融能量处理的单元格作为正常对照组。共分4组，每组6份标本。12 标本培

8、养关节软骨处理后，日期记录为第1 d，依照网格线全层取下关节软骨，沿中央切开，分为A、B两部分，A组织块(1 cm×05 cm)直接放入24孔培养板培养(DMEM培养基，100 mlLFBS，37 50 mlL CO2)，用于软骨细胞活性检测。B组织块电子天平称质量并记录，无菌下切成1 mm×1 mm×1 mm小块，放入24孔培养板培养，加入培养基10 ml，用于葡糖胺聚糖（glycosaminoglycan,GAG）释出率测定。每日换液。13 软骨组织块即时损伤观察指标131   HE染色培养后第4 d，将A组织块分为A1、A2 2部分，将A

9、1组织块放入10%福尔马林溶液中固定，经脱水、透明、制作蜡块、切片、HE染色，在显微镜下观察，坏死细胞的细胞核散大、消失，呈空泡状。高倍镜下取10个视野（表层5个，中层5个），细胞空泡率=空泡细胞/细胞总数×100%。132 细胞活性检测培养后第2 d，A2组织块用双面剃刀切成05 mm薄片，放入含3 mg/L二乙酸荧光素（flurescein diacetate,FDA)PBS液中，37 孵育5 min，然后，放入含10 mg/L碘化丽啶（propidium iodide,PI）PBS液孵育1 min，PBS液冲洗3遍，倒置荧光显微镜下观察。在蓝色激发光下活细胞呈绿色，在红色激发光

10、下死细胞呈鲜红色。使用双重曝光拍照，每份切片取6个视野（表层3个，中层3个）死亡率=死亡细胞/（死亡细胞+活细胞）×100%。133  软骨组织GAG释出率测定第4 d，把B组织块前3 d收集的培养基用阿利新蓝法测定GAG（glycosaminoglycan）含量2。根据组织块的原始质量，换算成GAG释放率。GAG相对释出量=GAG含量/组织块质量。统计学处理：应用SPSS 110统计软件，进行单因素方差分析法。2 结果21 HE染色对照组空泡率为1896%，15 W为2795%，与对照组相比，差异无显着性（P005）。当输出能量增加至40、70 W时，软骨细胞空泡率分别增

11、加至5507%、6513%，与对照组相比，软骨细胞空泡率明显增加（P005),结果见表1。22  细胞活性检测对照组死亡率为1783%，15 W为4465%，两组相比，差异无显着性（P005）。当输出能量增加至40 W及70 W时，软骨细胞死亡率为100%，与对照组相比差异具有显着性（P005），结果见表1。表1 细胞活性检测软骨细胞空泡率及死亡率(略)注：*与对照组比较         23 软骨组织GAG释出率测定射频消融输出能量达到15 W时，前2 d GAG相对释出率较对照组虽无显着性差异（P00

12、5），但释出率已经开始下降，输出能量增加至40 W及70 W时，GAG相对释出率较对照组下降明显（P005）,第3 d，各组间GAG相对释出率差异虽不显着（P005），但随着输出能量的增加，GAG相对释出率仍在减少，结果见表2。表2软骨组织GAG释出率(略)注：*与对照组相比P0053  讨论31  射频消融能量大小对关节软骨细胞的影响目前在软骨成形术中，对射频消融能量安全性的认识并不一致1。本研究HE染色结果显示，对照组空泡率为1896，15 W组为2795，与对照组相比，差异无显着性(P005)。当输出能量增加至40、70 W时，软骨细胞空泡率分别增加至5507、651

13、3，与对照组相比，软骨细胞空泡率明显增加(P005)。荧光染色结果显示，对照组死亡率为1793，15 W组为4465，两组相比，差异无显着性(P005)。当输出能量增加至40 W及70 W时，软骨细胞死亡率为100，与对照组相比差异具有显着性(P005)，且变性、坏死的空泡细胞与死亡的软骨细胞多集中于软骨表层。提示随着射频消融输出能量的增加，处理区域死亡的软骨细胞也随之增加，表层软骨细胞因离电极较近，较中层及底层软骨细胞相比，受到1王立勋,摘译.射频能量在治疗关节软骨面不平中对软骨细胞及基质的作用J.国外医学骨科学分册，2004，25(2)：127128.2 张惟杰.复合多糖生化研究技术M.第

14、2版，上海：上海科技出版社，1988，290.3 Ryan A,Bertone AL,Kaeding CC，et al.The effects of radiofrequency energy treatment on chondrocytes and matrix of fibrillated articular cartilageJ.Am J Sports Med,2003,31(3):386391.4 Lu Y,Hayashi K,Hecht P,et al.The effect of monopolar radiofrequency energy on partialthickness defects of articular cartilageJ.Arthroscopy,2000,16(5):527536.5 Kaplan.The acute effects of radiofrequency energy in articular cartilageJ.Arthroscopy,2000,16(8):87