金属硫蛋白对仔猪抗氧化功能及SOD基因表达的影响

1、金属硫蛋白对仔猪抗氧化功能及SOD基因表达的影响            金属硫蛋白对仔猪抗氧化功能及SOD基因表达的影响    2008-5-9 12:14:19                       &

2、#160;                                      作者：李丽立，刘云华，侯德兴，印遇龙，张彬，侯振平，邱细敏         

3、;【关键词】  金属硫蛋白；抗氧化酶；基因表达；仔猪       【Abstract】 AIM: To inverstigate the effects of exogenous Znmetallothionein (ZnMT) on antioxidative function and gene expression of SOD in weaning piglets. METHODS: Eighteen piglets (Duroc×Landrace×Yorkshire) were selected

4、and divided into 3 groups (1, 2 and 3) randomly. The piglets were sport to produce stress. ZnMT of piglet liver dissolved in physiological saline were then injected into the piglets of group 1, 2 and 3 with the concentrations of 0, 0.8, 1.6 mg/kg, respectively. Three and 6 h later, 3 piglets were se

5、lected from each group randomly and slaughtered to get liver samples. The biochemical indexes related to antioxidation and the level of SOD gene expression in liver were determined. RESULTS: After ZnMT injection, the activities of SOD and GSHPX increased significantly (P<0.05)， the content of MDA

6、 decreased significantly (P<0.05), and the level of antireactive oxygen species and antisuperoxide anion had the trend of improvement. Six hours after ZnMT injection, the level of SOD gene expression in group 2 and 3 increased significantly as compared with that in group 1 (P<0.05). The level

7、of SOD gene expression in group 2 and 3 at 6 h enhanced significantly as compared with that at 3 h. Thus, our data indicated that ZnMT treatment stimulated SOD mRNA expression in a time and dosedependent manner. CONCLUSION: Activity of antioxidase can be increased by supplement of ZnMT, thereby impr

8、oving the power of antistress.       【Keywords】 metallothionein; antioxidative enzyme;  gene expression; piglet       【摘要】 目的：用仔猪作模型，研究经锌元素诱导的外源性金属硫蛋白（ZnMT）对机体抗氧化功能和超氧化物歧化酶(SOD)基因表达的影响. 方法：选用杜长大杂交仔猪18头，随机分为3组(1,2和3）. 分别肌肉注射经生理盐水溶解的猪肝Zn

9、MT 0 mg/kg (1组），0.8 mg/kg （2组）, 1.6 mg/kg （3组），让仔猪运动产生应激. 注射MT后3 h和6 h，分别从每组取3头仔猪屠宰取肝脏，测定肝脏中与抗氧化有关的生化指标，检测肝脏SOD基因表达水平. 结果：在应激条件下，补充外源性ZnMT一段时间后，仔猪肝脏SOD，GSHPX活性显著升高(P<0.05)，MDA含量显著降低(P<0.05)，肝脏抗活性氧和抗超氧阴离子水平也有提高的趋势. 在注射ZnMT后6 h，0.8 mg/kg，1.6 mg/kg组仔猪肝脏SOD基因表达水平比对照组显著提高(P<0.05). 0.8 mg/kg组和1.6

10、 mg/kg组6 h SOD基因表达水平比3 h显著增加，表明MT对SOD基因表达的诱导与时间和剂量关系密切. 结论：补充外源性ZnMT可提高应激机体的抗氧化物酶活性，从而提高机体的抗应激能力.       【关键词】 金属硫蛋白；抗氧化酶；基因表达；仔猪        0引言       应激可使机体脂质过氧化反应增强，继而通过产生自由基造成组织损伤, 致生物体病变，生产力下降，甚至死亡. 金属硫蛋白（m

11、etallothionein, MT）是分子量低、富含半胱氨酸的金属结合蛋白. 研究表明，MT具有显著的清除自由基、抗脂质过氧化和增强机体免疫力的作用2-3. 因此，MT通过清除自由基，可增强抗氧化酶的活性，阻断脂质过氧化链式反应，减少膜脂质过氧化损伤，减少DNA损伤. 因而将MT应用于动物，完全有可能达到缓解氧化应激，提高生长速度，减少疾病的发生，减缓鲜肉氧化速度，延长动物利用年限，提高经济效益的目的. 但以往有关金属硫蛋白的抗氧化、抗应激研究以内源性为主，而且大都仅从抗氧化酶的活性变化来探讨金属硫蛋白清除自由基、抗氧化的作用. 有关MT在猪体内的研究鲜见报道. 基于此，我们以杜长大杂交仔猪

12、为对象，通过注射外源性ZnMT，测定肝脏与自由基有关的生化指标以及肝脏中SOD基因表达水平，从蛋白和基因水平探讨外源性ZnMT在应激状态下对抗氧化酶的影响.       1材料和方法       1.1材料选用胎次、日龄相同并且体质量相近的杜长大三元杂交雄性仔猪18头，14 d一次性断奶， 单栏饲养，自由采食和饮水. 试验前体质量（4.42±0.24）kg. 屠宰前1 d停食，不断水. 梯度PCR仪：德国Eppendorf生产，型号为5331055888；稳压稳流电

13、泳仪：北京六一仪器厂生产，型号为DYY6B；凝胶成像系统：美国UVP Biolmaging System生产，型号为GDS8000；紫外分析仪：北京六一仪器厂生产，型号为WD9403B；紫外分光光度计：德国Eppendorf生产，型号为603105430；超低温冰箱：青岛海尔股份有限公司生产，型号为BD396LT65W；台式离心机： 德国Eppendorf生产，型号为Centrifuge 5415D；低温离心机：德国Eppendorf生产，型号为Centrifuge 5810R；微波炉：青岛海尔股份有限公司生产，型号为HR6702DW. 猪肝ZnMT：本课题组提取的产品；BIOXYTECH S

14、OD525TM试剂盒：购自OXIS公司；谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPX)活力测定试剂盒、丙二醛(MDA)测定试剂盒、活性氧(ROS)测定试剂盒、超氧阴离子(SOA)自由基测定试剂盒：购自南京建成生物工程研究所；ISOGEN总RNA抽提试剂盒：购自日本基因株式会社；RTPCR试剂： 购自Amersham Pharmacia Biotech公司；琼脂糖及Tris： 购自Roche公司；Gene RulerTM 100 bp DNA Ladder：购自MBI Fermntas公司.       1.2方法   

15、    1.2.1试验设计将18头供试仔猪，随机分为3组，每组6头. 驱赶仔猪使其产生应激，然后3组分别肌肉注射经生理盐水溶解的猪肝ZnMT 0 mg/kg（1组），0.8 mg/kg（2组）,1.6 mg/kg（3组）. 在注射MT后3 h和6 h，分别从每组随机抽取3头仔猪，从前腔静脉放血屠宰，取肝脏，测定肝脏中与抗氧化有关的生化指标，检测肝脏SOD基因表达水平.       1.2.2样品采集解剖时取两份1 g左右的肝脏迅速用无菌锡铂纸包好并编号于液氮中速冻，再转移至-70冰箱中以备总RNA的抽提和

16、肝脏上清液的制备.   1.2.3肝脏上清液的制备取0.2 g左右经低温保存的肝组织在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称质量，放入玻璃匀浆管中，然后用移液管量取预冷的生理盐水(8.6 g/L)，生理盐水的体积是组织块质量的9倍. 将匀浆管下端插入盛有冰水混合物的器皿中，上下转动捣杆数10次，充分研碎，使组织匀浆化. 将制备好的100 mL/L的匀浆在4，3000 r/min离心15 min，取上清液.       1.2.4肝脏中与抗氧化有关的生化指标的测定肝脏上清液中SOD活性, GSHPX, MDA,

17、 ROS和SOA自由基水平的测定按各试剂盒说明书操作.       1.2.5基因表达分析采用半定量RTPCR方法，以3磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内标4.       总RNA的提取采用ISOGENLS总RNA抽提试剂盒，按说明书操作，提取的总RNA经紫外分光光度计测得A260/A280在1.82.0之间，可作为逆转录反应的模板.       引物设计根据网上(www.ncbi.nl

18、/)发表的基因序列（SOD：E06791， GAPDH：AF017079 ）采用引物设计软件进行设计，SOD上游引物：5 ATTCATGGCGACGAAGGC 3, 下游引物：5 TCAATTACACCACAGGCCA3, 扩增长度453 bp；内标GAPDH上游引物 5 TGAACGGATTTGGCCGCAT3, 下游引物5 TTCTCCATGGTCGTGAAGA3,扩增长度297 bp；引物均由日本株式会社DNA合成事业部合成.       RTPCR反转录聚合酶链式反应(RTPCR)用ReadtoGo RTPCR beads试剂采用一步法进行. &