荧光定量RT-PCR对水稻条纹病毒在水稻悬浮细胞内的基因表达分析

1、荧光定量RT-PCR 对水稻条纹病毒在水稻悬浮细胞内的基因表达分析1杨金广，郭利娟，李冠义，吴祖建，谢联辉福建省植物病毒学重点实验室，福建农林大学植物病毒研究所，福州（350002）E-mail ：摘 要：根据GenBank 中已有的水稻条纹病毒（Rice stripe virus, RSV）序列，设计了RSV 编码的7个基因的特异性引物，应用荧光定量RT-PCR 对RSV 7个基因在水稻悬浮细胞内的RNA 表达水平的变化进行了分析。结果表明在RSV 侵染水稻悬浮细胞后0 h、12 h、24 h、36 h、48 h和60 h均能检测到RSV 7个基因的存在。其中RdRp 基因的RNA 表达量在

2、RSV 侵染水稻悬浮细胞后12 h达到高峰，其表达量为侵染初期的45.07倍，与其它6个基因的RNA 表达量的变化显著不同。其它6个基因（NS2、NSvc2、NS3、CP 、SP 和NSvc4）的RNA 表达量均在RSV 侵染后48 h达到表达高峰，其RNA 表达量分别是侵染初期的21.08、10.92、11.99、140.14、50.19和1.54倍。上述表明RSV 侵染水稻悬浮细胞后48 h达到复制高峰。采用t -test 对RSV 7个基因在水稻悬浮细胞内病毒侵染复制过程中的RNA 表达量变化的差异显著性进行分析，结果显示RdRp 基因RNA 表达量的变化最显著，其t 值为2.67（P=

3、0.050.025）。CP 基因的RNA 表达量变化最稳定，其t 值为1.35（P=0.400.20）。 关键词：水稻条纹病毒；水稻悬浮细胞；基因表达；荧光定量PCR 中图分类号：S435.111.49水稻条纹叶枯病是东亚稻区主要的病毒病, 在我国温带和亚热带稻区发病尤为严重1-2，至今仍在江苏、河南、安徽、山东、辽宁、云南、北京和浙江等地严重危害。引起该病的水稻条纹病毒（Rice stripe virus, RSV）是纤细病毒属（Tenuivirus ）的代表种，是由灰飞虱（Laodelphax striatellus）传播的，具有双义编码策略的负单链RNA 植物病毒。其基因组由4条RNA

4、组成，可编码7个蛋白，除RNA1负义编码337 kDa的RNA 依赖的RNA 聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase, RdRp）外3，RNA2、RNA3和RNA4均为双义编码，即在正义链和负义链各编码一个蛋白。RNA2正义链和负义链分别编码22.8 kDa的NS2蛋白和94 kDa的NSvc2蛋白4。RNA3正义链编码一个23.9 kDa的NS3蛋白，负义链编码一个35 kDa的核衣壳蛋白（coat protein, CP）5。RNA4正义链和负义链分别编码20 kDa的病害特异性蛋白（disease-specific protein, SP）和32 kDa的蛋白N

5、Svc46-7。目前, 只有RdRp 、CP 和SP 3个基因功能初步确定 1，8-9，其它基因功能尚不明确。当前，关于RSV 在水稻细胞内复制的研究仅限于Yang et al. 10通过间接ELISA 对RSV CP 蛋白在水稻原生质体内的表达进行了检测。为了深入探讨RSV 在水稻细胞内的增值和基因表达的情况，我们应用较ELISA 更准确、精密和特异性的技术荧光定量RT-PCR ，对RSV 的7个基因在水稻悬浮细胞内的RNA 表达量的变化进行了研究，以期能够更加深入地揭示RSV 在水稻悬浮细胞内的复制变化，为进一步研究RSV 复制、病毒粒体装配以及基因功能提供科学依据。1材料与方法1.1 植

6、物材料、病毒毒源和试剂1本课题得到国家重点基础研究规划项目（973） （2006CB100203）、教育部博士点专项科研基金(20040389002； 20050389006；国家自然科学基金(30671357的资助。粳稻品种日本晴（Oryza sativa L. subsp. japonica cv. Nipponbare）为本研究所保存。病毒毒源采自江苏洪泽水稻田间呈典型水稻条纹叶枯病症状的病株，经RT-PCR 鉴定，分离纯化后，经灰飞虱传毒并保存于水稻植株中（台中1号）。发病病株用于RSV 提纯11。RNA 提取试剂盒Trizol Reagent为美国Invitrogen 公司产品；Ta

7、KaRa EXScriptTM RT-PCR Kit购于大连宝生物生物工程有限公司；荧光定量PCR 仪MiniOpticon TM System系统为美国Bio-Rad 产品。1.2 水稻悬浮细胞培养与RSV 侵染水稻悬浮细胞培养与RSV 侵染参照Yang et al. 的方法10。RSV 侵染水稻悬浮细胞后0 h、12 h、24 h、36 h、48 h和60 h取样，置于80条件下保存备用或者直接进行总RNA 提取。1.3 引物设计应用PerlPrimer 软件对RSV 7个基因的特异性引物进行设计12。为保证所设计引物的特异性，所选引物均在GenBank 数据库Blast 程序下进行比较分

8、析，以避免与水稻基因组任何序列同源。RSV 7个基因和内参基因水稻UBQ5基因的引物序列详见表1。表1 引物序列及预测片段大小Table 1 Primers and predicted amplification sizeGene Forward sequence(53 Reverse sequence(53 size/bpNS2 GAGCCTACTACAAGCCACATCAGCCAACCAAGACATAGTCATCACTARG 132 NSvc2 CATCCTTCTTTCTCTAAGTTCGGTCTCAACAGCATACACTATTCCCA 194 NS3 CATCGTCTGTGGGTTCT

9、GTG ATGCTCATCAATGGARGGGT 157 CP RTTGACAGACATACCAGCCAG CATCA TTCACTCCTTCCAAATAACY 243 SP TTGTCACTCMTTCCTATCTCAC TCTTCCACACTTTCTCATACTC 235 NSvc4 CAACCTCTCACYCATTACCC CGGACACTTGAAGATTATGCT 234UBQ513 ACCACTTCGACCGCCACTACTACGCCTAAGCCTGCTGGTT 69 R represent A or G；Y represent C or T；M represent A or C1.4

10、 总RNA 提取与real-time RT-PCR检测取植物样品0.1 g，于1 mL Trizol试剂中研磨，然后提取总RNA ，方法按公司提供的产品说明进行。20 l 反转录反应体系中含：总RNA 1 g 、3端引物（10 pmol） 1 l 、5ExscriptTM Buffer 4 l 、dNTP Mixture (各10 mmol/L 1 l 、Exscript TM RTase (200 U/l 0.5 l 、RNase Inhibitor (40 U/l 0.5 l ，最后用RNase Free dH2O 补足20 l 。反转录反应条件为：42反应15 min，95灭活2 min

11、。取1 l cDNA溶液加入以下试剂：2Premix Ex TaqTM 25 l 、3端引物和5端引物（10 pmol）各1 l 和dH 2O 22 l 。real-time PCR在50 l 反应体系中，于48孔MiniOpticon TM System系统中进行以下反应。95预变性10 s后，进行45个循环。每个循环为95变性6 s，62退火20 s。然后进行融解曲线制作，Real-time RT-PCR扩增产物的特异性均通过1琼脂糖凝胶电泳和每个基因的融解曲线进行鉴定。用 EASY Dilution 将cDNA 溶液按40、41、42、43和44梯度稀释后，各取1l 稀释后的cDNA 作

12、为模板进行real-time PCR灵敏性检测和标准曲线构建。1.5 数据分析根据内参基因的mRNA 的含量对所有样品进行归一化处理（初始RNA 量校正），然后确定每个目的基因在不同样品中的RNA 表达量。每个试验样品重复检测3次，并至少进行2次生物实验重复。利用t -test 对RSV 7个基因在RSV 侵染水稻悬浮细胞后0 h、12 h、24 h、36 h、48 h和60 h的RNA 表达量变化的差异显著性进行分析。2结果分析2.1 RSV 7个基因的扩增及其引物特异性的分析通过real-time RT-PCR对RSV 侵染后水稻悬浮细胞内的RSV 7个基因进行检测，结果显示从侵染初期的0

13、 h到侵染后60 h均能检测到RSV 7个基因的存在。其中RdRp 片段为124 bp, NS2片段为132 bp，NSvc2片段为194 bp，NS3片段为157 bp，CP 片段为243 bp，SP 片段为235 bp，NSvc4片段为234 bp，内参基因UBQ5片段69 bp，片段大小均与预期设计相符，电泳条带单一（图1）。并且这些基因的溶解曲线峰值单一（结果未显示）。这些特征表明，该研究中所应用的RSV 7个基因和内参基因的引物均符合基于SYBR Green I染料法的荧光定量PCR 检测的标准。2.2 RSV 基因在水稻悬浮细胞内的RNA 表达量的变化应用real-time RT-

14、PCR对RSV 7个基因在RSV 侵染水稻悬浮细胞后0 h、12 h、24 h、36 h、48 h和60 h的RNA 表达量进行实时定量分析。得到不同样品每个基因到达典型扩增的循环数C(T,根据每个基因标准曲线（图2A H ）和内参基因mRNA 的含量对不同样品进行归一化处理。结果表明，RdRp 基因的RNA 表达量在RSV 侵染水稻悬浮细胞12 h后达到最高值，其RNA 表达量为侵染初期的45.07倍，随后急剧下降（图3A ）。RSV 其它6个基因（NS2、NSvc2、NS3、CP 、SP 和NSvc4）的RNA 表达量均在RSV 侵染后48 h达到表达高峰值，分别为侵染初期的21.08、1

15、0.92、11.99、140.14、50.19和1.54倍，随后表达量一直呈下降趋势(图3B G 。其中NS2、NSvc2、NS3、CP 和SP 这5个基因的相对含量在048 h内，除个别时间段出现较小的下降外，总体均呈现上升趋势(图3B F 。而NSvc4基因RNA 含量在侵染后的1236 h内，均低于侵染初期的，在侵染后48 h发生较小的上调（图3G ）。以上结果表明RSV 侵染水稻悬浮细胞48 h后达到第一轮的复制高峰。M 12345678 1000500100300bp图1 RSV基因和内参基因UBQ5的real-time RT-PCR产物Fig.1 The amplicons of

16、RSV genes and internal control UBQ5 gene via real-time RT-PCR. M: 100 bp DNA ladder; 18: The amplicons of RdRp、NS2、NSvc2、NS3、CP 、SP 、NSvc4 and UBQ5 genes by real-timeRT-PCR in succession. 图8 RSV基因和内参基因UBQ5的标准曲线Fig.8 The standard curves of RSV genes and UBQ5 gene. A: RdRp; B: NS2; C: NSvc2; D: NS3; E

17、: CP; F: SP; G:NSvc4; H: UBQ5 图8 RSV基因在病毒侵染后不同时间RNA 相对表达水平Fig.8 The variances of RNA expression for RSV genes at different time post-infection. A: RdRp; B: NS2; C:NSvc2; D: NS3; E: CP; F: SP; G: NSvc4.2.3 RSV基因在水稻悬浮细胞内的RNA 表达量变化显著性分析利用t -test 对RSV 7个基因在RSV 侵染水稻悬浮细胞后0 h、12 h、24 h、36 h、48 h和60 h表达变化的差

18、异显著性进行分析。由表2可以看出，CP 基因的RNA 表达量变化是整个RSV 侵染复制过程中最稳定的，其t 值为1.35（P=0.400.20）。而RdRp 基因的RNA 表达量的变化最显著，其t 值为2.67（P=0.050.025）。NSvc2基因的RNA 表达量变化的显著性次之，t 值为2.27。而NSvc4、SP 、NS3和NS2基因在变化显著性上依次减小，其t 值分别为2.04、1.71、1.56和1.43。表2 RSV基因在病毒复制过程中变化的差异显著性Table 2 The different significances of RSV genesGene t P RdRp 0.0

19、50.025 NS2 1.43 0.400.20 NSvc2 2.27 0.100.05 NS3 1.56 0.200.10 CP 1.35 0.400.20 SP 1.71 0.200.10 NSvc42.040.100.053讨论在RSV 侵染水稻悬浮细胞的60 h内，除RdRp 的RNA 表达量在侵染后12 h达到表达高峰外，其它6个基因均在侵染后的48 h达到表达量的最大值。这与Yang et al.10报道的RSV 侵染水稻原生质体后20 h达到表达高峰稍有差异，推测这可能与RSV 侵染的水稻品种不同和水稻细胞形态存在差异以及侵染细胞的毒源不同有关。同时，表明RSV 进入细胞后，首先

20、利用寄主成分合成病毒转化的聚合酶RdRp ，其它基因则依赖RdRp 进行合成，推测RdRp 在 RSV 的复制过程中是至关重要的。 已有研究表明 RdRp 可在体外转录出 RSV 每条 RNA N 端和 C 端非编码区的保守序列9， 这也为以后制定抗 RSV 策略提供参考。 例如可以利用 RNA 介导技术对 RSV 的 RdRp 基因转录进行抑制， 这样可以从根本上抑制病毒在细胞内的复制， 从而达到抗病的目的。 RSV 是负单链 RNA 病毒，并具有双义编码策略。纯病毒的 RNA 提取物中含有 4 条 ssRNA 和 4 条 dsRNA, dsRNA 由 ssRNA 与它的互补 RNA 杂交退

21、火而形成的14。因此，病 毒脱壳后， 母代 RNA 中存在 ssRNA 和负链 RNA， 同一条 RNA 正链和负链分别编码的两个 基因可以同时复制子代 RNA。我们的研究结果也表明，除 RdRP 外，RSV 其它 6 个基因在 达到表达高峰值的时间没有差异，特别是同一条 RNA 上正链和负链编码的两个基因均是在 病毒侵染后 48 h 达到高峰， 推测 RSV 这 6 个基因可能是作为一个整体在水稻细胞内进行复 制表达。 Liang et al.通过体外核酸结合试验的研究推测 NSvc4 蛋白为 RSV 的运动蛋白 （movement protein, MP）15。本研究结果也进一步证明了该推

22、测。NSvc4 基因的 RNA 表达量在侵染初 期与高峰期之间的变化最小，其表达高峰期的含量仅为侵染初期的 1.54 倍，并且在病毒复 制过程中，NSvc4 基因在侵染后的 36 h 内，其 RNA 表达量一直低于侵染初期，在 48 h 升 高，随后又急剧下降。推测由于水稻悬浮细胞在液体培养基中处于游离状态，病毒难以在细 胞之间进行移动，作为运动蛋白基因的功能可能减弱，导致表达量减少。同时，这一结果还 与我们已有的研究结果存在一定的相关性。我们检测了不同传毒效率的灰飞虱体内 RSV 7 个基因的表达差异，显示 NSvc4 基因的 RNA 表达量与介体传毒能力呈正相关，而其它基因 的 RNA 表

23、达量变化与介体的传毒能力没有明显相关性（结果未发表） 。在 RSV 侵染水稻悬 浮细胞过程中，是通过 PEG 介导的方式，使病毒黏附和进入细胞内，在此过程中，没有经 过虫传途径，推测虫传相关蛋白的功能可能减弱或丧失。因此，推测 NSvc4 基因可能与灰 飞虱的传毒相关。 对 RSV 7 个基因在病毒侵染复制过程中进行差异显著性分析， 正义链编码的基因 （NS2、 NS3 和 SP） 变化的差异显著性均较小， CP 基因外， 除 RSV 其他 3 个负义编码的基因 （RdRp、 NSvc2 和 NSvc4）变化的差异显著性均较大。其中 RdRp 基因变化的差异显著性最大，而 CP 基因变化的差异

24、显著性却是 7 个基因中最小，表明 CP 基因在病毒复制过程中能够稳定 表达，并且 CP 还是病毒装配的核外壳蛋白，是病毒粒体的主要成分，因此，CP 基因可以 作为定量检测 RSV 的分子标记。 RSV 在自然界的传播途径是通过带毒灰飞虱刺吸水稻植株传播，在实验室的条件下， 灰飞虱的获毒能力和传毒能力较低，发病率一般低于 5。因此，在研究 RSV 与寄主互作 中，需要准备大量的实验材料。并且 RSV 侵染寄主后，其潜育期较长，需要 1030 天才能 表现症状。从病原物与寄主互作角度分析，待症状呈现时，RSV 与寄主在转录水平、蛋白 水平和代谢水平的互作均已近末期。本研究结果表明，在研究 RSV

25、 与寄主互作时，病毒侵 染后 48 h 病毒复制已达高峰，理论上也是病毒与寄主互作最激烈的阶段。因此，在以后利 用水稻悬浮细胞来研究 RSV 与水稻的互作中， 研究者可选择在病毒侵染 48h 时进行取样。这 为研究 RSV 与水稻的互作提供了基本的研究数据。 本研究利用 real-time RT-PCR 技术对 RSV 7 个基因在病毒侵染后 060 h 内的 RNA 表 达量变化进行了检测，揭示了 RSV 7 个基因在水稻悬浮细胞内的表达变化趋势，这些结果 为进一步研究 RSV 的复制与病毒粒体的装配以及 RSV 与寄主互作奠定了研究基础。但是， 只对 RSV 7 个基因进行了相对定量，不能

26、确定每个基因的拷贝数，因此同一时间点 RSV 基 -6- 因之间表达量的差异就很难确定。 需要构建每个基因的重组质粒， 利用不同浓度梯度的线性 重组质粒为模板进行 real-time PCR， 制作可以精确拷贝数的标准曲线。 这样才能确定每个细 胞内不同基因的拷贝数。同时，本研究也没有对 RSV 7 个蛋白进行实时定量检测。这些均 需要以后进行补充研究。 参考文献 1 Toriyama S. Rice stripe virus: prototype of a new group of viruses that replicate in plants and insects. Biocontro

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35、t Virology， Fujian Agricultural and Forestry University，Fuzhou (350002） Abstract In order to understand the variances of Rice stripe virus（RSV）coding genes (RdRp、NS2、NSvc2、 NS3、CP、SP and NSvc4 in RNA expression levels during the replication of the virus in rice suspension cells, seven specific prime

36、rs were designed based on all sequences of RSV in GenBank.The variances of RNA expression for 7 genes of RSV in rice suspension cells were investigated by reverse Foundation item: Major Project of Chinese National Programs for Fundamental Research and Development (2006CB100203; Doctoral Fund of Mini

37、stry of Education of China (20040389002; 20050389006; National Natural Science Foundation of China (30671357 -7- transcription real-time PCR. These 7 genes of RSV could be detected at various time (0 h、12 h、24 h、 36 h、48 h and 60 h post infection with RSV in rice suspension cells.The RNA expression of RdRp gene reached its peak at 12 h a