通腑法开通玄府对大鼠脑缺血再灌注损伤血脑屏障及脑组织水通道蛋

1、通腑法开通玄府对大鼠脑缺血再灌注损伤血脑屏障及脑组织水通道蛋白4 mRNA的影响         10-09-02 16:22:00     编辑：studa20            作者：胡建芳， 余志辉， 汪峰， 黄培新， 尤劲松  【摘要】  目的研究通腑醒神胶囊（简称TFXSJN）通腑法开通玄府对大鼠大脑中动脉阻塞（m

2、iddle cerebral artery occlusion，简称MCAO）再灌注损伤模型血脑屏障（blood brain barrier， 简称BBB）通透性及脑组织水通道蛋白4（Aquaporin-4，简称AQP4）mRNA表达的影响。方法采用线栓法制作大鼠MCAO模型,2 h后拔线造成缺血再灌注损伤。大鼠处死前2 h经股静脉注射伊文思蓝（Evans Blue，简称EB）并测量各组大鼠1，3 d及7 d时脑EB含量，以及拔线后12 h，1，2，3 d及7 d时间点大鼠神经行为评分、脑组织AQP4mRNA的表达水平。结果TFXSJN治疗后能明显减轻大鼠在1，2，3 d及7 d时的神经功能评

3、分，与模型组相比有明显差异（P<0.05或P<0.01）；造模后TFXSJN组、模型组脑EB含量在1，3，7 d时均明显高于假手术组（P0.05），1 d时开始升高，3 d时达高峰，7 d时有所下降，但仍高于正常，其中3 d时TFXSJN组EB含量明显低于模型组（P0.05），1，7 d时TFXSJN组EB含量均数亦低于模型组，但无统计学意义（P>0.05）；TFXSJN组及模型组大鼠脑组织损伤侧AQP4 mRNA的表达在12 h时已经明显升高，与健侧、假手术组及正常组相比均具有显著性差异（P<0.01）；模型组在3 d时达高峰，TFXSJN组在2 d时达高峰，3 d时

4、已有所下降，与模型组损伤侧相比有明显差异（P<0.05），但仍高于健侧（P<0.05）。7 d时两组损伤侧的AQP4 mRNA表达水平基本恢复正常，与健侧、假手术及正常组相比无明显差异（P>0.05）。假手术组在各时点内其损伤侧AQP4 mRNA表达水平与健侧及正常组相比均无明显差异（P>0.05）。结论脑急性缺血再灌注损伤时存在BBB通透性的增高和AQP4 mRNA基因表达的上调。而TFXSJN通腑法开通玄府法能够调节缺血再灌注损伤后BBB通透性增高与AQP4 mRNA表达的失衡，减轻缺血再灌注损伤，从而起到神经保护作用。其调节BBB通透性与AQP4mRNA基因的异常

5、表达可能是通腑法开通玄府治疗缺血性中风的分子机制之一。因此推测玄府与BBB及细胞膜上通道蛋白（如AQP4等）之间可能存在共同的实质内涵。 【关键词】  腑法 开通玄府 缺血再灌注损伤 血脑屏障 脑组织水通道蛋白4    中医认为中风病存在玄府郁闭的病理状态，通腑法的目的在于开通玄府，调节玄府功能。而对于玄府本质的认识，现代医家认为玄府是机体内最微小的腔道，在结构及功能上体现了“孔”“缝隙”的内涵实质，与现代医学的细胞间隙十分相似，与微循环、离子通道有着许多共性内涵1,2。因此，本实验旨在研究TFXSJN通腑法开通玄府对大鼠急性局灶性脑缺血再灌注损伤模型的

6、治疗作用及其对BBB通透性和神经细胞膜上AQP4 mRNA基因表达的影响，试图从调节BBB通透性及细胞膜上通道蛋白表达的异常来诠释通腑法开通玄府治疗急性缺血性中风的可能作用机制，探讨通腑法开通玄府与BBB及神经细胞膜上通道蛋白之间的相关性，有助于从现代科学的微观指标解释通腑法的实质内涵，为中风病的现代化研究及中西结合找到切入点和开拓新思路。1  材料与仪器1.1  动物及药物SPF级雄性SD大鼠，体重250300 g，由广州中医药大学动物实验中心提供（合格证编号：0014930）。TFXSJN由广东省中医院制剂科提供（由番泻叶、虎杖、人工牛黄、天竺黄、栝蒌仁等药物组成）。1

7、.2  材料及试剂TRIZOL (美国sigma 公司产品)、DEPC(美国sigma 公司产品)、玻璃匀浆器、1.5 ml Eppendorf管、氯仿、异丙醇、无水乙醇、2伊文思蓝、甲酰胺、超低温离心机(BE CKMAN QS-15R Centrifuge)、螺旋振荡器、70冰箱、紫外分光光度计(Ultrospec4000)、1.5%琼脂糖凝胶、SSIII逆转录试剂盒(Invitrogen公司产品)、PCR扩增试剂盒(北京天为时代公司产品)、AQP-4上、下游引物及探针（序列参考相关文献，由上海生工合成）、PE7000全自动荧光定量PCR仪。2  方法2.1 

8、分组与给药SPF级雄性SD大鼠138只，体重250300 g。随机分为正常组（n6）、假手术组（n36）、模型组（n48）、TFXSJN组（n48）。TFXSJN按大鼠1.5g/kg·d计算药量，按动物系数折算，相当于70 kg成人临床剂量的3倍。均于术前一天及术后麻醉清醒后，每日分两次灌胃给药（TFXSJN组）或者蒸馏水（正常组，假手术组，模型组），2 ml/次，上下午各1次。各组动物如有死亡应及时补充。2.2  MCAO缺血再灌注大鼠模型建立大鼠MCAO模型制作参照koizumi线栓法3，从右侧颈总动脉（Common carotid artery，简称CCA）进线，栓线

9、采用尼龙渔线，长约4 cm，直径约0.26 mm，进线深度约1.8 cm,术后2 h拔出线栓约1.5 cm形成缺血再灌注损伤。大鼠术中及清醒前均给予白炽灯（100 W）照射，保持肛温36左右，室温25。假手术组渔线插入CCA深度为0.5 cm，其余操作均同手术组。各组动物如有死亡应及时补充。2.3  脑组织伊文思蓝(Evans Blue，EB)含量的测定1，3 d及7 d时每组各取6只大鼠，于处死前2 h经股静脉注射2伊文思蓝2 ml/kg，2 h后开胸通过左心室灌注生理盐水(灌注压为100 mm Hg)，直到右心房流出无色液体为止，迅速断头取脑，分开大脑半球，去除蛛网膜、血凝块及脑

10、室脉络丛，测量右侧大脑半球的重量并记录，置已知体积的甲酰胺中，测量脑体积，继续加甲酰胺至脑体积的5倍，置37水浴48 h后轻轻摇匀，3 000 r/min离心后取上清液，用紫外分光光度计测定在波长632 nm处的光密度值，甲酰胺作空白比色，根据标准曲线计算出EB含量(mgml)。脑EB含量为上述值的5倍。2.4  AQP4 mRNA表达的实时定量RT-PCR检测2.4.1  脑组织总RNA的提取TFXSJN组及模型组大鼠于再灌注后12 h，1，2，3，7 d（假手术组于术后1，3，7 d）各取6只断头处死，取距额极5 mm的2 mm厚大脑冠状切面层，分别取梗死损伤侧（右侧）

11、及健侧（左侧）提取总RNA。总RNA的提取按GibcoBRL公司提取试剂盒说明操作，提取的总RNA于70冰箱保存备用。2.4.2  RNA含量的测定及质量的观察取2 l RNA稀释后在紫外分光光度计上分别测定260，280 nm的OD值，用OD260计算RNA含量，并计算OD260/OD280的比值。另取4 l于1.5%琼脂糖凝胶中电泳观察RNA的质量，若28 s与18 s真核细胞tRNA比值为21，表明RNA无降解。2.4.3  cDNA的合成按Invitrogen公司逆转录试剂盒说明进行，取总RNA约2 g与1 l Oligo dT（50 mol/L）、1 l dNTP

12、(10 mm)加DEPC-H2O至10 l，在0.5 ml Eppendorf管中混匀，65变性5 min后放置冰浴中约1 min，离心片刻，然后与预先混匀的1 l Rnase out，1l SSIII(200 U/ml)，2 l 10×RT buffer，4 l  MgCl2（25 mm），2 l DTT(0.1 m)一起混匀，离心片刻，置反应体系中50（50 min），85 5 min，然后冰浴1 min，离心片刻，加入1 l Rnase H,37下反应20 min。反应产物用于直接PCR扩增或储存于20冰箱以备用。2.4.4  荧光定量RTPCR检测AQP4

13、 mRNAAQP4 mRNA引物及探针的序列由上海生工设计与合成，上游引物（5-3）： CGG AGC CAG  CAT GAA TCC ；下游引物（53）：GAA ACT GGG AAA ACC ACT GGA TA ；探针（53）：CTC GAT  CCT TTG GCC CTG CAG TTA TCA。探针标记：5端为FAM，3端为TAMARA标记。阳性标准品由英韦创津公司提供。采用不同浓度的阳性标准品（浓度分别为107，106，105，104）制作标准曲线。 RealTime Q-PCR反应体系如下：cDNA（或标准品）2 l上、下游引物各1 l探针0.5 lTaq

14、酶1 l10×Taq buffer5  ldNTP mixture 5 l，加ddH2O至总体积为50 l。循环条件：50 2 min95 10 min40个循环（90 15 s，60 60 s）。PE7000全自动荧光定量PCR仪在反应结束后，将参照标准曲线，通过电脑分析和计算，得到各组大鼠在不同时间点AQP4 mRNA基因表达的起始拷贝数。2.4.5  统计学处理各组EB含量及AQP4 mRNA基因表达水平结果用±s，组间均数两两比较采用方差分析（q检验）。检验水平0.05。     10-09-02 16:2

15、2:00     编辑：studa203  结果3.1  各组大鼠在不同时间点神经功能评分比较根据评分标准，清醒后予以评分，评分在14分的大鼠为纳入对象。结果表明假手术组大鼠在各个时点均未出现明显的神经功能缺损症状。TFXSJN组及模型组大鼠在拔线时的神经功能缺损评分无明显差异（P>0.05）。而1，2，3 d及7 d时TFXSJN组大鼠的神经功能缺损评分明显低于对照组（P<0.05或P<0.01）。结果见表1。表1  两组大鼠在不同时点神经功能缺损评分比较（略）3.2  各组大鼠在不同时点脑组织

16、EB含量的比较结果见表2。表2  各组不同时点脑组织EB含量（略）与假手术组比较，*P0.01；与模型组比较，P0.05；与同组1 d时点比较，#P0.05；n=6    由表2可以看出，1，3，7 d时TFXSJN组、模型组脑EB含量明显高于假手术组（P=0.000，P<0.01），提示缺血再灌注损伤可致BBB通透性增高；组内不同时点间比较：TFXSJN组及模型组的EB含量在1 d开始升高，3 d达到高峰，7 d有所下降；假手术组3个时点比较无差异（P=1.000，P>0.05）。其中3 d时TFXSJN组脑EB含量明显低于模型组（P=0.

17、022，P<0.05）；1，7 d时TFXSJN组EB含量均低于模型组，但P分别为0.165，0.124，均0.05，无统计学意义，考虑可能与样本含量偏小有关，提示TFXSJN可改善缺血再灌注所致的BBB通透性的增高。3.3  各组大鼠不同时间点AQP4mRNA表达的比较经过全自动荧光定量PCR仪的定量检测，根据标准品不同的浓度梯度，生成标准曲线，通过电脑分析和计算，得到各组大鼠在不同时间点AQP4 RNA基因表达的起始拷贝数，经过对数转换，然后进行方差分析，表3是各组大鼠在不同时间点脑组织健侧（左侧）及损伤侧（右侧）AQP4 mRNA表达水平的比较。表3中每组每侧数据的上排是

18、FQ-PCR表达的起始拷贝数（拷贝/gRNA ×106），下排是拷贝数的对数。表3  各组大鼠在不同时间点，脑组织左侧与右侧AQP4mRNA表达水平的比较（略）    从表3可以看出，TFXSJN组及模型组大鼠脑损伤侧（右侧）AQP4 mRNA的表达在12 h时已经明显升高，与健侧（左侧）相比具有明显差异（P<0.05）,以后继续升高，模型组在3d时达高峰，与健侧、假手术组及正常组相比均具有显具性差异（P<0.01）；而TFXSJN组2 d时达高峰，3 d时已有所下降，与模型组损伤侧相比有明显差异（P<0.05），但仍高于健侧

19、（P<0.05）。7 d时两组损伤侧的AQP4 mRNA表达基本恢复正常，与健侧、假手术组及正常组相比无明显差异（P>0.05）。假手术组在各观察时点内其损伤侧与健侧及正常组相比均无明显差异（P>0.05）。4  讨论    缺血性脑水肿是中风急性期的一个重要病理改变。缺血早期，离子泵功能衰竭，导致细胞毒性水肿；缺血后数分钟，缺血区毛细血管内皮细胞及其周围的胶质细胞开始肿胀，内皮细胞间紧密连结开放，基底膜溶解、脱落、节段性缺损， BBB遭到破坏，毛细血管通透性增加，产生血管源性水肿，使脑水肿进一步加重，以再灌注12 h3 d时脑水肿、出

20、血最为严重4。因此BBB的破坏是脑缺血再灌注损伤时重要的病理生理改变。目前多采用分光光度计法检测渗入到大鼠脑组织内的EB含量来作为判断BBB通透性改变、血管源性脑水肿的定性指标。同时研究也显示在脑缺血时AQP4通道的非正常开放与血脑屏障破坏、血管源性脑水肿的形成密切相关5。研究发现AQP4在缺血6 h即增强，3 d达高峰，7 d恢复正常6。AQP4在急性水中毒脑水肿的大鼠水肿侧的脑内高表达，而在正常侧低表达。而应用基因敲除技术发现，缺乏AQP4基因的大鼠缺血性中风时引起的脑水肿明显减轻，说明抑制AQP4的表达有助于脑水肿的治疗7,8。    对于缺血性脑水肿的认识

21、，中医认为水淫脑之玄府、浊毒损脑是其基本病机。玄府病变是中医学的最基本病机，刘氏指出中风病存在玄府闭塞，气血不通，神机不遂的病机。“水淫玄府”导致玄府开阖通利功能障碍，津液渗灌失常，津停为水，淤滞玄府，水积成浊而引起脑水肿9。对于中风病的治疗，刘氏强调宣通玄府，开发郁结，“所谓结者，怫郁而气液不能宣通也，非谓大便结硬也”，指出通腑法所通的不仅仅只是胃肠之腑，也包括无物不有的微观玄府。通腑攻下在于开通“玄府”而不在于攻下燥屎，故运用指征不拘于大便之结硬与否。研究表明通腑法治疗急性中风可以减轻神经元的损伤，提高临床疗效，改善患者预后1011。TFXSJN是广东省中医院脑病中心根据多年的临床经验研制

22、而成的，由番泻叶、虎杖、人工牛黄、天竺黄、栝蒌仁等药物组成，以番泻叶、虎杖为君药，番泻叶通腑泻下，虎杖活血化淤、化痰解毒，又有泻下作用，与番泻叶合用具有协同之功；人工牛黄、天竺黄熄风豁痰、开窍醒神为臣药；栝蒌仁润肠化痰。诸药合用，可使壅滞之邪得以迅速清泻，逆乱之气血得以纠正，达到通腑醒神、豁痰开窍、开通玄府的功效。经多中心临床验证，疗效显著，有降低患者的致死率、致残率和并发症，提高生活质量等作用12。实验旨在研究TFXSJN通腑法开通玄府、调节玄府功能对大鼠脑缺血再灌注损伤的治疗作用及其对BBB通透性与AQP4 mRNA表达的影响，试图从BBB通透性与AQP4 mRNA表达水平的角度阐述通腑法开通玄府治疗中风的实质内涵。本研究结果表明大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤存在着BBB通透性的增高及AQP4 mRNA表达的上调，EB含量在1 d开始升高，3 d达高峰，7 d有所下降；AQP4 mRNA表达的上调在12