脑缺血再灌注动物模型的制备及评价

1、脑缺血再灌注动物模型的制备及评价         11-02-14 11:30:00     作者：马志健，罗刚，易西南    编辑：studa20【摘要】  目的：观察不同脑缺血再灌注动物模型的脑损伤程度，探讨不同脑缺血再灌注模型的应用。方法：制备双侧颈总动脉阻断再灌模型(BCCO)、线栓法大脑中动脉脑缺血再灌模型(MCAO)、四血管法全脑缺血再灌模型(GI)，采用海马CA1区MAP2免疫组织化学染色观察其脑损伤情况，Mor

2、ris水迷宫评价其行为学。结果：MAP2免疫表达显示GI组脑损伤最严重，CA1区细胞数量最少，MAP2表达最低，而BCCO组脑损伤最轻，CA1区细胞数量无明显减少，MAP2表达仅略有降低。行为学研究表明，MCAO和GI组行为学明显改变。结论：不同的脑缺血模型的应用不同，BCCO模型可用于轻微缺血的预防，MCAO模型适用于局部损伤后脑功能改变及治疗药物评价，GI是研究缺血损伤后恢复相对理想的模型。 【关键词】  脑缺血;脑损伤;动物模型;大鼠ABSTRACT Objective: To investigate the application of three kinds of cere

3、bral ischemiareperfusion animal model according to the degree of injury. Methods:The bilateral common carotid artery occlusion(BCCO), cerebral middle cerebral artery occlusion (MCAO) by stringfastening method, global ischemia(GI) by fourartery occlusion were used to establish cerebral ischemiareperf

4、usion animal model. The degree of brain injury was evaluated through the expression of MAP2 in hippocampal CA1 region and the Morris water maze. Results: The result of the expression of MAP2 indicated the injury of GI group was the most severe, and the damage of BCCO group was the most mild.Compared

5、 with the normal group,the behavior change of reperfusion was the significant in the MCAO and GI groups. Conclusion:The three animal models should be applied in different researches. The BCCO model could be used in prevention of mild ischemia. The MCAO model could be used in the change of cerebral f

6、unction and the drug evaluation. The GI model could be used in recovery after cerebral ischemia.KEY WORDS Cerebral ischemia; Cerebral injury; Animal ; Rat脑血管疾病是世界上严重危害人类健康的三大疾病之一, 发病率已达到104. 53/10万。缺血性脑血管疾病( ICVD ) 发病率有逐年增高趋势, 死亡率可达56. 6%80% , 即使存活, 也留有严重的后遗症影响生活质量。因此, 建立合适的动物脑缺血及缺血再灌注模型来模拟人类脑血管疾病并对

7、之进行研究, 是深入研究其病变发生、发展和预后的基础，也是当前神经科学的热门课题之一。大鼠具有脑血管解剖结构和功能与人类相近似、品种品系相对标准、良好的种内纯合性等特点，目前大多利用大鼠建立脑缺血再灌模型，但是对各种模型的制作效果未见文献报道。本文采用双侧颈总动脉阻断再灌模型(BCCO)、线栓法大脑中动脉脑缺血再灌模型(MCAO)、四血管法全脑缺血再灌模型(GI)等3种常用的局灶性脑缺血再灌动物模型，观察不同脑损伤情况下的形态学改变，并评价其行为学，旨在探讨不同模型的适应性。1 材料与方法1.1 实验动物及分组健康雄性Wistar大鼠，6月龄，体重(200±50) g，经Morris

8、水迷宫筛选后，分为正常对照组(Normal)，双侧颈总动脉结扎20 min再灌注组(BCCO)，线栓法大脑中动脉脑缺血再灌模型组(MCAO)，四血管法全脑缺血再灌模型组(GI)，每组6只。1.2 Morris水迷宫测试Morris水迷宫测试程序采用定位航行试验：每天4次，共3 d，均在10:00am5:00pm之间完成。将大鼠头朝池壁轻轻放入水中，计时动物自入水至找到平台时间为潜伏期，同时观察搜索站台的轨迹。记录大鼠后8次测试的潜伏期，以平均潜伏期的90%区间作为筛选学习记忆功能正常大鼠的标准。1.3 动物模型制备BCCO模型：大鼠用2%的戊巴比妥(0.2 mL/100 g)麻醉，颈正中切口逐

9、层切开皮肤及皮下组织，分离胸锁乳突肌，切断二腹肌前腹，暴露颈总动脉(common carotidartery， CCA)，颈内动脉(internal carotid artery， ICA)和颈外动脉(external carotid artery，ECA)，分离双侧颈总动脉约1 cm，用动脉夹夹闭20 min后，解除动脉夹，恢复脑血流，再灌7 d，在处死前做Morris水迷宫测试。MCAO模型：参照Longa等1和罗勇等2报道的方法,采用经颈内动脉线栓法制备大鼠右侧MCAO致局灶性永久性脑缺血模型。大鼠用2%的戊巴比妥(0.2 mL/100 g)麻醉，仰卧位固定，颈正中切口，暴露右侧CCA、

10、ICA和ECA，探查ECA在颈部发出第1分支(甲状颈干)处，在其远心端约0.2 cm处结扎并切断ECA，确保ECA残端长度不少于0.5 cm;结扎并切断ECA与ICA之间的交通支。用动脉夹暂时阻断CCA及ICA血流，用眼科剪于ECA 残端作一纵行小切口，用直径约0.2 mm的尼龙线，烧灼头端使其成为直径约为0.25 mm的线栓，将线栓从右侧ECA残端插入ICA;轻轻牵拉ECA残端，使其与ICA成一条直线，调整线栓角度，使线栓弧度水平向外，与颈前正中线呈45度水平向外的夹角，移去夹闭ICA的动脉夹，轻轻将线栓送入颅内。从CCA分叉处送入ICA约1.92.1 cm时通常可遇阻力，大鼠呼吸、心跳突然

11、加快，部分大鼠尿失禁，据此作为大脑中动脉起始处栓塞成功的标志。栓塞成功后，用丝线结扎ECA残端，移去夹闭CCA的蛙心夹，观察无活动性出血后关闭切口。缺血20 min后，将栓线抽至颈内动脉起始部恢复脑血流，再灌7 d，在处死前做Morris水迷宫测试。GI模型：参考Pulsinelli方法，采用改良的四血管夹闭方法制备四血管阻塞全脑缺血模型3，4。大鼠用2%的戊巴比妥(0.2 mL/100 g)麻醉，仰卧位固定，颈正中切口，暴露CCA和与之伴行的神经,钝性分离出CCA，用棉线环CCA成1cm的线环。两侧线环相互交叉埋于皮下，缝合切口。大鼠转移到立体定位仪上, 俯卧。头向下倾斜30 度固定。剪去头

12、颈部的毛, 消毒。在枕骨下沿背正中切口,分离肌肉, 找到第1颈椎后弓上的横突孔, 用电凝针插入23 mm，灼断孔中的椎动脉, 使之永久性阻塞。电凝完毕, 缝合切口，大鼠放回饲养笼中, 让其自然苏醒, 禁食过夜, 自由饮水。以上手术24 h 后, 大鼠在清醒状态下仰卧固定, 重新打开颈部切口, 用动脉夹夹闭双侧颈总动脉, 使大鼠脑部供血完全阻断, 大鼠挣扎数秒后于3060 s 内昏迷, 解除固定, 可见大鼠四肢上举, 翻正反射消失, 痛觉反应消失, 双侧瞳孔散大, 眼球呈灰白色, 身体可呈角弓反张。缺血20 min后，解除动脉夹，恢复脑血流，再灌7 d，在处死前做Morris水迷宫测试。1.4

13、组织制备用2%戊巴比妥钠(0.12 mL/50 g体重)腹腔注射麻醉后，迅速开胸暴露心脏，灌注固定后取脑，后固定24 h后，分别置于15%和30%蔗糖梯度溶液中直至标本沉底。冰冻切片机作连续冠状切片，取海马和齿状回互包平面，片厚30m，用小鼠抗MAP2单克隆抗体作ABC免疫组织化学染色，用正常羊血清代替一抗作阴性对照。1.5 统计学处理用HPIAS高清晰度彩色病理图像测量系统测定海马CA1区神经元胞浆MAP2反应产物的OD值，并减去同一张切片的背底OD值，即矫正的OD值(COD值)，每例标本检测3张切片，每张切片检测3个视野。实验数据用SPSS 13.0统计软件分析，采用单因素方差分析比较样本均数。2 结果2.1 水迷宫检测正常大鼠定位航行试验潜伏期稳定