基因与分子生物学考试+位景香

1、第一讲染色体1、 染色质与染色体的基本概念染色体（chromosome）是细胞在有丝分裂时遗传物质存在的特定形式，是间期细胞染色质结构紧密包装的结果。真核生物的染色体在细胞生活周期的大部分时间里都是以染色质(chromatin)的形式存在的。染色质是一种纤维状结构，叫做染色质丝，它是由最基本的单位核小体(nucleosome)成串排列而成的。1.DNA 包装成染色（质）体的重要性(1)压缩以适应细胞的微小空间(2)保护 DNA(3)便于DNA复制与分离(4)便于调控基因表达和实现基因重组2.染色体的复制与分离染色体DNA关键序列:(1)自主复制序列（autonomously replicati

2、ng sequence，ARS）：与染色体DNA复制有关(2)着丝粒序列（centromere DNA sequence，CEN）：与染色体复制后平均分配到子代细胞中有关(3)端粒DNA序列（telomere DNA sequence，TEL）：与染色体的稳定性有关3. 端粒（telomere）:染色体末端的特化结构，由端粒DNA和端粒蛋白质构成。2、 核小体 核小体与组蛋白的结构1. 核小体的组装（1）DNA首先结合H3.H4四聚体（2）与2个H2A.H2B二聚体结合形成核小体（3)H1最后加入三、DNA的修复、重组与转座DNA突变与修复问题（1.）DNA如何足够快速修复以防止错误成为突变存

3、在于遗传物质中复制子中的35外切酶元件可将错误掺入的核苷酸去除（2.）在修复过程中如何区分母链与子链？MutH对切割位点和DNA链的选择1. 切割5-GATC-3的52. 切割5-GATC-3中A未甲基化的DNA链（3）当DNA断裂或严重损伤致使原有序列不能被读取时，细胞如何修复正确的DNA序列？（4）细胞如何应对阻碍复制的损伤？1. 错配修复将逃脱校正读码的错误去除MutS识别并结合到错配碱基处MutS和错配的DNA共同募集MutL和MutHMutL激活MutH，MutH在错配碱基附近切断一条链UvrD解旋酶从切口向错配碱基方向解开DNA双链核酸外切酶VIII或RecJ，或核酸外切酶I去除含

4、有错配碱基的DNA片段由DNA聚合酶III填补空缺并由DNA连接酶结合2 .DNA dmageIntroduction of DNA mutation and repair类型 损伤 酶错配修复 复制错误 E.coli中MutS、MutL和MutH人类中MSH、MLH和PMS光激活作用 嘧啶二聚体 DNA光解酶碱基切除修复 受损的碱基 DNA糖基化酶核苷酸切除修复 嘧啶二聚体 E.coli中UurA、B、C、D,人类 碱基上的大加合物 XPC/A/D、ERCCI-XPF以及XPG双链断裂修复 双链断裂 E.coli中RecA和RecBCD移损DNA合成 嘧啶二聚体或脱嘌呤位点 Y家族DNA聚合

5、酶，如E.coli的UmuC3.切除修复 (excision repair)3.1碱基切除修复（base excision repair）DNA糖基化酶识别错误碱基并将其除去，形成脱氧戊糖AP核酸内切酶切除脱碱基戊糖DNA聚合酶I以未受损的DNA链为模板合成新链，DNA连接酶连接新链3.2核苷酸切除修复（nucleotide excision repair）UvrA-UvrB识别并结合损伤碱基所产生的扭曲位点，且UvrA脱离UvrB使损伤碱基附近DNA变性，产生单链凸起UvrB募集UvrC，UvrC在错误碱基两侧切开DNAUvrD除去被切割的DNA片段，Pol和连接酶修补缺口4转录偶联的DNA

6、修复：a。RNA聚合酶在损伤上游正常转录DNA。（P279）b。遇到1损伤时，RNA聚合酶受阻，转录停止c.RNA聚合酶招募核苷酸切除修复蛋白到损伤部位，修复蛋白能触及损伤5. 同源重组机制的Holliday模型两个同源DNA排列整齐DNA断裂，产生单链区（288）链入侵，产生异源双螺旋DNAHolliday联结体的形成Holliday联结体的剪切Ø补丁产物(patch product)Ø剪接产物(splice product)6.移损DNA合成（282）A复制时一旦在模板中遇到损伤，DNA聚合酶III与滑动夹一起从DNA脱落下来b.被移损DNA聚合酶取代。C。移损DNA聚

7、合酶越过模板链受损部位，继续进行DNA合成，且被DNA聚合酶III取代。7.RecBCD的作用机制（295）RecBCD结合于DNA断裂末端，向chi位点方向打开双链RecB沿35降解单链DNA， RecD沿53降解单链DNA RecC识别chi位点，RecD丧失活性， RecB沿53降解单链DNA，而不再沿35降解单链DNA8.RecA蛋白的功能 ：促使链的入侵 Ø主要位点结合单链DNA Ø次要位点结合双链DNAØ链交换（299-303）RuvAB的功能：促进分支移动 ØRuvA-RuvB结合到联结体 ØRuvB促使DNA分支移动RuvC的功

8、能: 剪切Holliday联结体 ØRuvC在同一方向的同源DNA链打开缺口 5A/T-T-T-G/C3ØDNA连接酶连接缺口9（608） 酿酒酵母HO基因的表达调控3.2 控制酿酒酵母交配型的基因座ØMAT基因座（mating-type locus）（312）l交配型a：a1基因，编码a1调控蛋白l交配型：1和2基因，1和2调控蛋白la/： a1、 1和2，编码a1、1和2调控蛋白3.3 酿酒酵母交配型基因的组合控制 3.3.1 调控酵母类型的调控蛋白l交配型a：a1调控蛋白，Mcm1l交配型：1和2调控蛋白，Mcm1la/： a1、1和2调控蛋白，Mcm13.

9、3.2交配型a酵母的确立ØMcm1调控蛋白激活a型细胞特异基因的表达；无活化子，型细胞特异基因关闭Ø单倍体特异基因表达3.3.3交配型酵母的确立Ø2抑制子和Mcm1抑制a细胞特异基因的表达Ø1和 Mcm1协同激活型细胞特异基因Ø单倍体特异基因表达3.3.4 a/型酵母的确立Ø2抑制子和Mcm1抑制a细胞特异基因的表达Ø无活化子，型细胞特异基因关闭Øa1和2二聚体关闭单倍体特异基因四、位点特异性重组和DNA转座（320）1.保守性位点特异性重组（CSSR）1.1重组位点 重组酶识别序列 对称分布 交换区（crosso

10、ver region）1.2重组结果 DNA片段的插入DNA片段的缺失DNA片段的倒位1.3.1丝氨酸重组酶1.3.2酪氨酸重组酶（326）（322）丝氨酸重组酶特异位点重组功能丝氨酸重组酶的4个亚基分别切断2个DNA分子的4条链，并且重组酶通过磷酸二酯键与DNA断裂端相连重组酶二聚体亚基旋转进行DNA片段交换DNA链上-OH攻击重组酶-DNA磷酸二酯键，重新形成DNA磷酸二酯，释放重组酶，完成重组1,3,3Cre重组酶位点特异性重组（328）2. l整合酶催化基因整合和切除（329） 3Hin重组酶（331） 4Xer重组酶催化（335）五转座（337）2.1转座因子（transposabl

11、e element）或转座子（transposon）：从DNA上的一个地方移位到另外一个地方的遗传因子。2.2转座因子的类型 2.2.1 DNA转座子2.2.2 LTR (long terminal repeat) 反转录转座子 2.2.3 聚腺苷酸(poly-A)反转录转座子（339）2.2.1 DNA转座子2.2.1.1自主转座子（autonomous transposon） 2.2.1.2非自主转座子（nonautonomous transposon）2.2.1.1 DNA自主转座子 反向重复序列（具有转座酶识别序列） 转座酶基因2.2.1.2非自主转座子 反向重复序列（具有转座酶识别序

12、列）DNA 转座子：玉米的Ac/Ds转座系统Ac：含5个外显子的单个基因，产物为转座酶; 末端有11bp的IR和8bp的DR，DR由靶位点重复而成。Ds：比Ac短，不同Ds缺失的长度不同； 末端有11bp的IR。2.2.2 LTR 反转录转座子 两端有LTR (long terminal repeat) LTR中含有反向末端重复序列转座酶基因和反转录酶基因2.2.3 聚腺苷酸(poly-A)反转录转座子5-UTR: untranslated region 3-UTR (聚腺苷酸序列的A-T碱基对)ORF1: 编码RNA结合蛋白 open reading frameORF2: 编码的蛋白质同时具

13、有反转录酶和核酸内切酶功能2.3DNA转座的剪切-粘贴机制（342）转座酶识别并聚集转座子两端的反向重复序列，形成转座体 将DNA转座子从原始位置切除 DNA单链交换，即转座子的3-OH与靶DNA的5-P相连DNA聚合酶和DNA连接酶修复缺口3.DNA复制性转座（345）4.类病毒反转录转座子和反转录病毒通过RNA中间体实现移位（347）5. 聚腺苷酸(poly-A)反转录转座机制（352）6.Mu噬菌体是一种异常活跃的转座子（361）l 很少有靶位点的偏好性l 每小时能完成100轮的转座l 参与转座酶的酶MuA:转座酶 MuB：ATP酶，促进MuA的活性7.V(D)J重组（366）六、基因的

14、表达与调控原核基因表达调控模式1、转录水平上的调控（transcriptional regulation）2、转录后水平上的调控（post-transcriptional regulation）  mRNA加工成熟水平上的调控   翻译水平上的调控1.原核操纵子的结构组成（1)结构基因群操纵元中被调控的编码蛋白质的基因可称为结构基因(structural gene, SG)。一个操纵元中含有2个以上的结构基因，多的可达十几个。每个结构基因是一个连续的开放读框, 5端有翻译起始码,3端有翻译终止码。各结构基因头尾衔接、串连排列，组成结构基因群。至少在第一个结构基因5侧具有核糖

15、体结合位点。核糖体在合成完第一个编码的多肽后，核糖体可以不脱离mRNA而继续翻译合成下一个基因编码的多肽，直至合成完这条多顺反子mRNA所编码的全部多肽。（2)启动子 (3)操纵基因操操纵元中同一操纵序列与不同构像的蛋白质结合，可以分别起阻遏或激活基因表达操纵元中同一操纵序列与不同构像的蛋白质结合，可以分别起阻遏或激活基因表达的作用(4)调控基因（regulatory gene）是编码能与操纵序列结合的调控蛋白的基因。与操纵子结合后能减弱或阻止其调控基因转录的调控蛋白称为阻遏蛋白（repressive protein），其介导的调控方式称为负性调控（negative regulation）。与

16、操纵子结合后能增强或起动其调控基因转录的调控蛋白称为激活蛋白（activating protein），所介导的调控方式称为正性调控（positive regulation）。(5)终止子 终止子（terminator，T）是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列。在一个操纵元中至少在结构基因群最后一个基因的后面有一个终止子。 终止子按其作用是否需要蛋白因子的协助至少可以分为两类：一类是不依赖因子的终止子，这类终止子在序列上有一些共通的特点，即有一段富含GC的反向重复序列（inverted repeat sequence），其后跟随一段富含AT的序列（见图7-6），因而转录生成的mRNA的序列

17、中能形成发夹式结构，后继一连串U，正是RNA聚合酶转录生成的这段mRNA的结构阻止RNA聚合酶继续沿DNA移动、并使聚合酶从DNA链上脱落下来，终止转录。另一类是依赖因子的终止子，即其终止转录的作用需要因子的协同，或至少是受因子的影响。 不同的终止子的作用也有强弱之分，有的终止子几乎能完全停止转录；有的则只是部分终止转录，一部分RNA聚合酶能越过这类终止序列继续沿DNA移动并转录。如果一串结构基因群中间有这种弱终止子的存在，则前后转录产物的量会有所不同，这也是终止子调节基因群中不同基因表达产物比例的一种方式。 有的蛋白因子能作用于终止序列，减弱或取消终止子的作用，称为抗终止作用（antiter

18、mination），这种蛋白因子就称为抗终止因子（antiterminator）。2、原核基因调控机制的类型与特点根据操纵子对调节蛋白（阻遏蛋白或激活蛋白） 的应答，可分为：正转录调控 负转录调控正转录调控：与操纵子结合后能增强或起动其调控基因转录的调控蛋白称为激活蛋白（activating protein），所介导的调控方式称为正性调控（positive regulation）。负转录调控：与操纵子结合后能减弱或阻止其调控基因转录的调控蛋白称为阻遏蛋白（repressive protein），其介导的调控方式称为负性调控（negative regulation）。3、根据操纵子对某些能调节它

19、们的小分子的应答，可分为可诱导调节和可阻遏调节两大类： 可诱导调节（P196）：指一些基因在特殊的代谢物或化合物的作用下，由原来关闭的状态转变为工作状态，即在某些物质的诱导下使基因活化。 例：大肠杆菌的乳糖操纵子 分解代谢蛋白的基因酶合成的诱导操纵子模型诱导物：如果某种物质能够促使细菌产生酶来分解它，这种物质就是诱导物。调节基因操纵基因结构基因阻遏蛋白诱导物mRNA酶蛋白 可阻遏调节：基因平时是开启的，处在产生蛋白质或酶的工作过程中，由于一些特殊代谢物或化合物的积累而将其关闭，阻遏了基因的表达。例：色氨酸操纵子 合成代谢蛋白的基因酶合成的阻遏操纵子模型辅阻遏物：如果某种物质能够阻止细菌产生合成

20、这种物质的酶，这种物质就是辅阻遏物。4、在负转录调控系统中，调节基因的产物是阻遏蛋白（repressor），起着阻止结构基因转录的作用。根据其作用特征又可分为负控诱导和负控阻遏： 在负控诱导系统中，阻遏蛋白与效应物（诱导物）结合时，结构基因转录； 在负控阻遏系统中，阻遏蛋白与效应物（辅阻遏物）结合时，结构基因不转录。5、在正转录调控系统中，调节基因的产物是激活蛋白（activator）。 根据激活蛋白的作用性质分为正控诱导和正控阻遏 在正控诱导系统中，效应物分子（诱导物）的存在使激活蛋白处于活性状态； 在正控阻遏系统中，效应物分子（辅阻遏物）的存在使激活蛋白处于非活性状态。6、转录水平上调控的

21、其他形式（1）、因子的更换 在E.coli中,当细胞从基本的转录机制转入各种特定基因表达时，需要不同的s因子指导RNA聚合酶与各种启动子结合。（2）、降解物对基因活性的调节葡萄糖存在时,在细菌培养物中加入乳糖,半乳糖,阿拉伯糖,麦芽糖等不会引起相应的操纵子启动（3）、弱化子对基因活性的影响7、乳糖操纵子（550）主要内容： Z、Y、A基因的产物由同一条多顺反子的mRNA分子所编码这个mRNA分子的启动子紧接着O区，而位于I与O之间的启动子区（P），不能单独起动合成-半乳糖苷酶和透过酶的生理过程。操纵基因是DNA上的一小段序列（仅为26bp），是阻遏物的结合位点当阻遏物与操纵基因结合时，lac

22、mRNA的转录起始受到抑制。诱导物通过与阻遏物结合，改变它的三维构象，使之不能与操纵基因结合，从而激发lac mRNA的合成。当有诱导物存在时，操纵基因区没有被阻遏物占据，所以启动子能够顺利起始mRNA的合成。8、1）、lac操纵子的本底水平表达有两个矛盾是操纵子理论所不能解释的：诱导物需要穿过细胞膜才能与阻遏物结合，而转运诱导物需要透过酶，后者的合成有需要诱导。解释：一些诱导物可以在透过酶不存在时进入细胞？ 一些透过酶可以在没有诱导物的情况下合成？真正的诱导物是异构乳糖而非乳糖，前者是在-半乳糖甘酶的催化下由乳糖形成的，因此，需要有-半乳糖甘酶的预先存在。解释：本底水平的组成型合成：非诱导状

23、态下有少量的lac mRNA合成。2）大肠杆菌对乳糖的反应3）阻遏物lac I基因产物及功能Lac 操纵子阻遏物mRNA是由弱启动子控制下组成型合成的，每个细胞中有5-10个阻遏物分子。当I基因由弱启动子突变成强启动子，细胞内就不可能产生足够的诱导物来克服阻遏状态，整个lac操纵子在这些突变体中就不可诱导。4）葡萄糖对lac操纵子的影响如果将葡萄糖和乳糖同时加入培养基中，lac操纵子处于阻遏状态，不能被诱导；一旦耗尽外源葡萄糖，乳糖就会诱导lac操纵子表达分解乳糖所需的三种酶。 代谢物阻遏效应5）cAMP与代谢物激活蛋白代谢物激活蛋白（CAP）/环腺甘酸受体蛋白（CRP9、CAP的正调控无葡萄

24、糖，cAMP浓度高时促进转录 有葡萄糖，cAMP浓度低时不促进转录10、协同调节当阻遏蛋白封闭转录时，CAP对该系统不能发挥作用如无CAP存在，即使没有阻遏蛋白与操纵序列结合，操纵子仍无转录活性。 cAMPCAP复合物与启动子区的结合是转录起始所必需的。单纯乳糖存在时，细菌利用乳糖作碳源；若有葡萄糖或葡萄糖/乳糖共同存在时，细菌首先利用葡萄糖。11、色氨酸操纵子（trp operon）特点: (1) trpR和trpABCDE不连锁；(2) 操纵基因在启动子内 (3) 有衰减子(attenuator)/弱化子 (4) 启动子和结构基因不直接相连，二者被前导序列(Leader)所隔开 色氨酸操纵

25、子表达的调控有两种方式:a.通过阻遏蛋白的负调控b.通过衰减子作用trp 操纵子的阻遏系统 ： 低Trp时：阻遏物不结合操纵基因;高Trp时：阻遏物+Trp 结合操纵基因trp 操纵子的转录衰减的调控 ：衰减子（attenuator）/弱化子 前导序列（leader sequence）1）弱化子： DNA中可导致转录过早终止的一段核甘酸序列（123-150区）。研究引起终止的mRNA碱基序列，发现该区mRNA通过自我配对可以形成茎-环结构，有典型的终止子特点。2）、前导序列：在trp mRNA5'端trpE基因的起始密码前一个长162bp的mRNA片段。3、）弱化机制细菌通过弱化作用弥

26、补阻遏作用的不足，因为阻遏作用只能使转录不起始，对于已经起始的转录，只能通过弱化作用使之中途停下来。阻遏作用的信号是细胞内色氨酸的多少；弱化作用的信号则是细胞内载有色氨酸的tRNA的多少。它通过前导肽的翻译来控制转录的进行，在细菌细胞内这两种作用相辅相成，体现着生物体内周密的调控作用。12、半乳糖操纵子(galactose operon)异构酶(galE) 乳糖-磷酸尿嘧啶核苷转移酶(galT) 半乳糖激酶(galk)。gal操纵子的特点：它有两个启动子，其mRNA可从两个不同的起始点开始转录；它有两个O区，一个在P区上游，另一个在结构基因galE内部。13、阿拉伯糖操纵子（arabinose

27、 operon)araB基因、araA基因和araD, 形成一个基因簇，简写为araBAD 三个基因的表达受到ara操纵子中araC基因产物AraC蛋白的调控ara操纵子的调控有两个特点：第一，araC表达受到AraC的自身调控。第二，AraC既是ara操纵子的正调节蛋白（需cAMP-CRP的共同参与，起始转录），又是其负调节蛋白。这种双重功能是通过AraC蛋白的两种异构体来实现的（Pi和Pr)。B）葡萄糖很丰富且没有阿拉伯糖情况下，AraC与操纵基因araO2和AraC的一个结合位点araI结合，结合于araO2和araI的两个AraC蛋白之间互相结合，形成一个约210碱基对的一个环，从而使

28、araBAD启动子的转录被抑制，基因araB、A、D不被转录，阻止操纵子的转录（负调节作用）C）当葡萄糖不存在（或低水平）而阿拉伯糖存在时，CAP-cAMP很丰富，与araI附近的CRP结合位点结合，阿拉伯糖与AraC蛋白结合改变了构象，成为激活子，DNA环被打开，能与CAP-cAMP协同诱导araBAD基因的转录（阳性调控或正调节）阿拉伯糖和葡萄糖均不存在或阿拉伯糖和葡萄糖均丰富时，操纵子均处于阻遏状态。14、原核生物转录的整体调控模式l 由成群的操纵子组成的基因转录调控网络称为调节子。通过组成调节子调控网络，对若干操纵子及若干蛋白质的合成进行协同调控，从而达到整体调控的目的。l 典型的整体

29、调控模式是SOS反应，这是由一组与DNA损伤修复有关的酶和蛋白质基因组成。在正常情况下，这些基因均被LexA阻遏蛋白封闭。当有紫外线照射时，细菌体内的RecA蛋白水解酶被激活，催化LexA阻遏蛋白裂解失活，从而导致与DNA损伤修复有关的基因表达。15、转录后水平上的调控1.翻译起始的调控 RBS（核糖体结合位点）：mRNA链上起始密码子AUG上游的一段非翻译区。 RBS的结合强度取决于SD序列的结构及其与起始密码子AUG之间的距离。 SD- 4-10（9）-AUGSD （ Shine-Dalgarno ）序列：在起始密码AUG上游413个碱基之前有一段富含嘌呤的序列，其一致序列（consens

30、us sequence）为AGGAGG，能与核糖体30S亚基中16S rRNA 3端富含嘧啶的序列结合，与蛋白质合成过程中起始复合物生成有关。16.稀有密码子对翻译的影响dnaG(引物酶) RNA引物dnaG、rpoD和rpsU属于大肠杆菌基因组上的同一个操纵子50个拷贝的dnaG蛋白、2800个拷贝的rpoD和40000个拷贝的rpsU七、基因的表达与调控真核基因表达调控模式(586)调控真核生物和原核生物之间的相似1.原理是相同的：信号激活剂和阻遏 募集和变构（异构），协同结合2.进行调控的基因表达的步骤是类似的，并且转录起始是最普遍地调节步骤。Difference in reg

31、ulation between eukaryotes and prokaryote1. ）Pre-mRNA splicing adds an important step for regulation. (mRNA前体的剪接)2. )The eukaryotic transcriptional machinery is more elaborate than its bacterial counterpart. (真核转录机器更复杂)3. )Nucleosomes and their modifiers influence access to genes. (核小体及其修饰体) 4. )Man

32、y eukaryotic genes have more regulatory binding sites and are controlled by more regulatory proteins than are bacterial genes. (真核基因有更多结合位点) Eukaryotic activators-Example 1: Gal43.Eukaryotic activators-Example 1: Gal4 活化子 ØDNA结合域和激活域功能分离实验介绍系列 2 酵母双杂交3. 调控蛋白DNA结合域的类型(591)3.1同型结构域蛋白质（酵母2抑制子） 

33、16;3个螺旋 Ø2个螺旋形成螺旋-转折-螺旋Ø识别螺旋 结合大沟 Ø结合螺旋 结合主链 Ø协助螺旋 协助识别和结合螺旋结合DNA3.2含锌DNA结合域Ø锌原子与2个组氨酸残基和两个半胱氨酸残基相连接（Gal4）l1个识别螺旋l2个折叠Ø锌原子与4个半胱氨酸残基相互作用l类似螺旋-转折-螺旋的结构3.3亮氨酸拉链结构域（GCN4活化子）Ø2个螺旋Ø二聚化区l适当间隔的亮氨酸残基 ØDNA结合区3.4螺旋-环-螺旋蛋白（小鼠MyoD活化子）Ø长螺旋 l识别结合DNA大沟 l二聚化功能Ø短

34、螺旋l二聚化功能4. 活化子DNA激活域的类型Ø酸性激活域（Gal4）Ø谷氨酰胺激活域（SP1）Ø脯氨酸激活域（CTF1）5.活化子的作用方式(594)活化子的作用方式1.活化子间接募集RNA聚合酶2. 活化子募集核小体修饰物改变启动子染色质性质3. 活化子募集蛋白因子促使转录起始和延伸6.活化子间接募集RNA聚合酶ØRNA聚合酶不能单独直接结合启动子Ø转录因子（Transcription factor）协助RNA聚合酶结合启动子：TFIIDØ中介蛋白协助RNA聚合酶结合启动子活化子通过募集转录因子或中介蛋白促使RNA聚合酶结合到启动

35、子上Ø活化子募集作用的证明（Gal4活化子）（594）ChIP) (染色质免疫共沉淀) to visualize where a given protein (activator) is bound in the genome of a living cell.) （实验介绍系列3）(激活子旁路实验)-Activation of transcription through direct tethering of mediator to DNA. （实验介绍系列4）（595）7. 活化子募集核小体修饰物改变启动子染色质性质（595）2.2 核小体修饰物的种类乙酰转移酶 乙酰化组蛋白中的

36、赖氨酸核小体重塑复合体 重塑核小体2.3 活化子募集乙酰转移酶乙酰化组蛋白松弛核小体上的DNA，释放启动子，有利于RNA聚合酶结合启动子组蛋白的乙酰化提供具有同源调节域转录因子（TFIID）的结合位点2.4活化子募集重塑复合体重塑核小体Ø核小体沿DNA滑动，暴露出启动子，有利于 RNA聚合酶的结合3. 活化子募集蛋白因子促使转录起始和延伸4. 绝缘子阻挡活化子对启动子的激活作用（599）8. 基因的适当调控需要基因座控制区（LCR）（599）9.转录抑制（611）11、信号整合1）激活蛋白联合作用来整合多种信号（551）1. 活化子联合作用促进信号整合多个活化子各募集转录机器的同一组

37、分多个活化子各募集转录机器的不同组分多个活化子之间相互帮助结合DNA（603）（604）（605）2. 多个活化子之间相互帮助结合DNA2.1 两个活化子直接相互作用结合DNA2.2 两个活化子通过同一个蛋白结合DNA2.3 一个活化子募集核小体修饰物来促使另外一个活化子结合DNA 2.4 一个活化子结合核小体DNA暴露另外一个活化子结合位点12.组合调控（607）组合调控是真核生物复杂性和多样性的核心。它属于协作调控的一种具体方式。在组合调控中，激活蛋白和阻遏蛋白共同起作用。啤酒酵母的交配型的组合调控（608）同上13.信号传导（612）信号传导的机制：信号经常通过不同方式控制转录调节蛋白的

38、活性Mechanism 1: unmasking an activating region揭露活化区域（615）Mechanism 2: Transport into and out of the nucleus 运输进入和离开细胞核（664b）Other Mechanisms #1: A cascade of kinases that ultimately cause the phosphorylation of regulator in nucleus (new) 激酶级联，最终导致监管者的磷酸化核664aOther Mechanisms #2: The activated recepto

39、r is cleaved by cellular proteases (蛋白酶), and the c-terminal portion of the receptor enters the nuclease and activates the regulator 激活受体被细胞蛋白酶（蛋白酶）切割，而受体的c-末端部分进入核酸酶和激活调节器664c14.基因“沉默”由组蛋白修饰及DNA（616）在酵母中的沉默是通过对组蛋白的去乙酰化和甲基化介导的（617）在果蝇中，HP1蛋白识别甲基化的组蛋白和浓缩的染色质。DNA甲基化与哺乳动物细胞的沉默基因相关联。【注DNA甲基化不是组蛋白甲基化】（62

40、1）15.基因表观遗传控制有些基因表达状态在起始信号不存在时仍然在细胞分裂中遗传。（624）DNA甲基化通过细胞分裂维持（625）16.真核基因调控在转录起始后水平HSP70 gene：（597）17.RNAs基因沉默（640）八、分子生物学常用实验技术n 核酸电泳技术n 核酸的限制性酶切及片段长度多态性n 核酸分子杂交n 核酸体外扩增技术PCR1. 核酸电泳技术按照分子量大小，形状和拓扑学特性进行DNA 和 RNA分子的分离Ø DNA 与 RNA 带负电荷, 在凝胶中朝正极（）移动Ø 线状 DNA 分子按照分子量大小进行分离Ø 环状DNA的迁移受其拓扑学结构特性

41、的影响。分子量相同的环状 DNA有不同的形状，其迁移率不同：超螺旋> 线状>开环或松弛态分离不同大小的DNAn 分子量小的 DNA（1-1000bp）: 用聚丙烯酰胺n 分子量大的 DNA（0.2-50kb): 用琼脂糖n 大片段DNA(>30-50kb): 用脉冲电场凝胶电泳2.核酸的限制性酶切及片段长度多态性限制性内切酶特点：1）特异性识别序列2）特异性切割位点限制酶识别序列长度通常为碱基对，大多呈回文序列。限制性内切酶图谱：也称DNA物理图谱，是DNA链上某些限制性内切酶酶切位点的图谱，可作为DNA片段的特殊标记。是DNA特征的证据。DNA限制性内切酶酶切图谱的建立识别

42、4个核苷酸的内切酶，在DNA链上出现机率为: 1 / 441 / 256bpA、部分酶解法：n 完全酶解 3 ，2， 1 kbn 部分酶解 6，5，4，3，2, 1 kbn 分析 5=3+2 4=3+1 3在中间B.两种以上限制性内切酶交叉酶解法： 总长 EcoR Hpa 3kb 1.7，0.9，0.4 1.6，1.4 EcoR+ Hpa 1.2 , 0.9 , 0.5 , 0.4 分析： Hpa一个切点，可肯定EcoR1.7 kb不在末端，在中间EcoR 0.9和0.4 kb都在末端 逻辑判断以上二片段在哪一边末端C.同位素末端标记，部分酶解法限制性片段长度多态性（RFLP）的检测在一个特定

43、基因座位上，存在着两个或两个以上的等位基因，其中任何一个在人群中频率不低于10%，这就是多态性但现在认为不同个体中同一位点上DNA核苷酸序列产生变异，且在人群中发生频率大于1%，就可认为是多态性。如在限制性内切酶酶切位点发生核苷酸的变异（或多态性），就会产生RFLP，除SNP外，还包括缺失、重复、插入、基因重排以及串联重复序列拷贝数的变异限制性酶切的应用(1) 鉴定是否是需要的DNA片段(2) 建立基因组图谱(3) 遗传性疾病的研究和诊断n 根据多态性片段寻找与疾病相关的基因n 诊断： 直接检测 连锁分析3. 核酸分子杂交 把亲源关系较近的，不同生物个体来源的变性DNA或RNA单链，经退火处理

44、形成DNA-DNA或DNA-RNA这一过程叫分子杂交。核酸分子杂交技术的原理有互补特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混在一起时，其相应同源区段将会退火形成双链结构。 如把一段已知基因（DNA或RNA）核酸序列用合适标记物（如放射性同位素、生物素等）予以标记，当作探针（probe), 与变性后的单链基因组DNA或RNA进行杂交。 再用合适方法（如放射自显影或免疫组织化学等技术）把标记物检测出来，就可确定靶核苷酸序列是否存在、拷贝数及表达丰度等应 用：(1)检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系；(2)用来揭示核酸片段中某一特定基因的存在与否、拷贝数及表达丰度。 3.1 Southern 印迹杂交

45、此技术由Southern 1975年首先设计。被检测对象为DNA。吸水纸转膜：玻璃-滤纸-凝胶-尼龙膜-滤纸（厚吸水纸）-玻璃板-重物3.2 Northern印迹杂交与Southern杂交类似。检测目的RNA的存在与否及含量。3.3 Western印迹杂交将待检测蛋白质（或酶）经PAGE电泳并染色后，转移到滤膜上固定，再用“抗体-抗原”免疫反应或“DNA-protein”结合反应鉴别滤膜上的蛋白质。3.4 斑点印迹杂交和狭线印迹杂交Dot blotting and slot blotting适于核酸样品定量检测，而不是定性检测。3.5 原位杂交in situ hybridization分为菌落

46、、噬菌斑及真核细胞原位杂交3.6 生物芯片生物芯片（biochip）是近年来在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术，主要是指通过微加工技术和微电子技术在固体芯片表面构建的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、DNA及其他生物组分的准确、快速与大信息量的检测。 生物芯片的分类(1) DNA芯片(Gene chip, DNA chip, DNA microarray)(2) 蛋白质芯片(Protein chip)(3) 芯片实验室(Lab-on-a-chip)基因芯片n 基因芯片：是指将大量探针分子固定在物体表面，与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度，进而获取样品

47、分子的数量和系列信息。n 它以其可同时、快速、准确地分析数以千计的基因组信息而显示巨大威力。n 目前，基因芯片已经应用于基因表达检测、寻找新基因、杂交测序、基因突变等许多方面。蛋白芯片：是以蛋白质代替DNA作为检测对象，比基因芯片更进一步接近生命活动的物质层面，因而有着比基因芯片更加直接的应用前景。 DNA芯片技术的基本原理：DNA芯片技术的基本原理是分子识别，与Southern杂交和Northern杂交同出一理，即DNA的碱基互补配对和序列互补原理。 DNA芯片技术流程芯片方阵的构建样品制备生物分子反应信号的检测及分析 DNA芯片应用可在基因组水平进行基因表达和发现研究、突变、序列测定等，已

48、方泛应用于基因组研究和人类疾病的诊断等多领域。4. 核酸体外扩增技术-PCRPCR能做什么？n PCR反应可以在2小时内提供大量的目标DNA片断n 模板DNA不需要高度纯化n PCR产物能用于限制性内切酶消化、测序和克隆n PCR可从一根毛发、一滴血、甚至单个DNA细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定影响PCR的主要因素Template DNAReaction buffer (Tris, KCl, Mg2+, BSA)dNTPsPrimersDNA polymerasePCR反应条件变性、退火、延伸温度循环次数温度循环参数n 模板变性温度决定双链DNA解链温度n 引物退火温度退火温度决

49、定PCR特异性与产量n 引物延伸温度温度的选择取决于Taq DNA聚合酶的最适温度n 循环次数常规PCR一般为2540个周期 扩增结束后，样品冷却并置4保存引物(1)引物设计原则 引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。 引物碱基：G+C含量以45-55%为宜。 避免引物内部出现二级结构，形成发夹结构；避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体。 引物3端的碱基，最好是G或C。 正向与反向引物的退火温度大致相同，一般为50-65 。 引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。(2) 引物Tm反应的退火温度应根据两个Tm（一般相差2-4）折中选择 较低的

50、退火温度检查扩增的可能性较高的退火温度最佳特异性(3) 引物辅助设计Primer Premier 5.0DNA 聚合酶 Klenow片段Taq DNA聚合酶来源大肠杆菌水栖高温菌（Thermus aquatics）YT1蓖株有无35外切酶活力有无最适温度37 , 扩增的产物并非全是目的序列，需用探针检测7475产率高，特异性也高。到达平台的循环次数2030延伸片段长度400bp以内10kb以内影响PCR特异性的因素退火步骤的严格性：提高退火温度可以减少不匹配的杂交，从而提高特异性。减短退火时间及延伸时间可以减少错误引发及错误延伸。引物二聚体是最常见的副产品，降低引物及酶的浓度也可以减

51、少错误引发，尤其是引物的二聚化。改变MgCl2(有时KCl)浓度可以改进特异性，这可能是提高反应严格性或者对Taq酶的直接作用。模板中如果存在次级结构，例如待扩增的片段易自行形成发夹结构时，可在PCR混合物中的4×dNTPs中加入7-脱氮-2-脱氧鸟苷-5-三磷酸 (de7GTP)。用de7GTP与dGTP比例为3：1的混合物代替dGTP，则可阻非特异性产物的生成。(1）不对称PCR目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探

52、针基因组DNA结构功能的研究(2)反向PCR (reverse PCR) 是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。3）多重PCR是指在一个单一反应中同时扩增多个序列的反应过程，能够节省时间和精力.4）LP-PCR（Labelled primers)利用同位素、荧光素等对引物进行标记，用以直观地检测目的基因。 特别适合大量临床标本的基因诊断可同时检测多种基因成分5）锚定PCR（anchored PCR）

53、锚定PCR：使用一条锚定引物就一条特异性引物扩增已知一端序列的目的DNA。 6）PCR固相分析法7）原位 原位聚合酶链式反应（In Still PCR，IsPCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段，在不破坏细胞的前提下，利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。 直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行扩增。可进行细胞内定位。 适用于检测病理切片中含量较少的靶序列原位PCR的作用 既往鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交（ISH），但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于10的情况下，该方法的敏感度就明显下降。而标准的PCR则

54、可扩增出细胞内单拷贝的序列，敏感度很高，但却未能与细胞形态学研究相结合。 ISPCR则可把这两者结合起来，成为细胞学诊断中一种崭新的检测技术。利用该法可检测细胞内病毒感染、细胞内基因重排、以及分析细胞内RNA表达产物等方面发挥一定作用。在检测细胞的潜在感染方面也具有重要意义。操作步骤： 细胞或组织的固定PCR扩增细胞内目的片段原位杂交检测扩增产物8）定量PCR：是指以外参或内参为标准,通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测,进行PCR起始模板量的定量。用于扩增已知一端序列的目的DNA 实时荧光定量PCR定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 。实时荧光定量PCR 原理 实时原理 1）实时荧光定量PCR 原理 - 扩增曲线2）实时荧光定量PCR 原理 -荧光阈值3）实时荧光定量PCR 原理 -Ct值4）实时荧光定量PCR 原理-Ct值的重现性Ct值的特点：§ 相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；§ Ct值则极具