果胶裂解酶可供公开征求意见用内容

1、（二）食品添加剂的通用名称、功能分类、用量和使用范围1. 通用名称通用名称来源a供体b果胶裂解酶里氏木霉黑曲霉PectinlyasTrichoderma reeseiAspergillus niger本文叙述的果胶裂解酶是通过里氏木霉发酵生产的， 该里氏木霉携带有来自黑曲霉的果胶裂解酶编码基因。2. 功能分类果胶裂解酶收录于 GB2760-2014食品添加剂使用标准中， 为允许使用的食品用酶制剂，其来源的微生物为黑曲霉。本次申报的果胶裂解酶来源于里氏木霉， 该菌种未收载在 GB2760-2014规定的果胶裂解酶来源的微生物名单中。 因此，特申请里氏木霉来源的果胶裂解作食品用酶制剂新品种。3.

2、使用量和使用范围最大使用量食品分类号食品名称备注(mg/kg ）14.02果蔬汁类及其饮料按生产需要适量使用15.03.03果酒按生产需要适量使用04.01.02.06果泥按生产需要适量使用15.03.01葡萄酒按生产需要适量使用依据现行良好生产规范（GMP）要求，建议以达到预期效果的最小添加量使用该酶。（三）证明技术上确有必要和使用效果的资料或者文件 食品添加剂的功能类别、作用机理1、功能类别本次申报的果胶裂解酶功能为食品用酶制剂，主要用于果蔬汁类及其饮料、果酒、果泥、葡萄酒的加工。我国食品添加剂国家标准 GB2760-2014已收载来源于黑曲霉的果胶裂解酶，并广泛应用在食品加工中。但 AB

3、EnzymesGmbH出品的果胶裂解酶来源于里氏木霉，与 GB2760-2014规定的果胶裂解酶菌种来源不同， 因此特申请里氏木霉来源的果胶裂解酶作为食品用酶制剂。2、作用机理果胶酶是一类分解果胶物质的酶的总称。常见的果胶酶有三种： 果胶裂解酶（ PL）、果胶甲基酯酶（ PE）及多聚半乳糖醛酸酶（ PG）。果胶的分解可通过两种不同的机理实现： PE/PG模式和 PL模式。果胶结构及果胶酶的作用如下图示： PE/PG 模式果胶甲基酯酶（ PE）可随机切除甲酯化果胶中的甲基产生甲醇和游离羧基，该过程对于果胶溶液的粘度几乎没有影响。多聚半乳糖醛酸酶（ PG）能切断果胶酸的-1,4 糖苷键，促进聚半乳

4、糖醛酸链水解。 PG 酶根据水解机理分为内切酶及外切酶两种，内切酶从分子内部无规则的切断 -1,4 糖苷键，可使果胶粘度迅速下降； 外切酶从分子末端逐个切断-1,4糖苷键，粘度下降不明显。PE 酶去甲酯化，是 PG 酶继续作用进一步分解果胶链的前置条件。因此，PE、PG 酶是复配作用的。果胶甲基酯酶（ PE）和多聚半乳糖醛酸酶（ PG）共同作用，称之为PE/PG 模式。首先由果胶甲基酯酶去除甲基，形成果胶酸及游离的甲醇；然后多聚半乳糖醛酸酶进一步作用将果胶酸分解成小分子，最终达到将果胶大分子分解成小分子的作用。该过程产生的游离甲醇会残留在最终成品中。对于果胶含量高或者酯化度高的果蔬品种，比如红

5、枣、山楂、蓝莓等，控制成品的甲醇含量成为一个难题。市场上的果胶分解酶基本上都是此种类型。 PL 模式果胶裂解酶通过反式消去作用切割 -1,4 糖苷键，在半乳糖醛酸的非还原末端形成 C4 和 C5 不饱和键。果胶裂解酶是唯一通过反式消去作用降解高酯化果胶的果胶酶，而不需要果胶酯酶的酯化作用。AB Enzymes GmbH出品的果胶裂解酶即为该类型，其对果胶的分解是在没有预先去酯的情况下， 以反式消去的模式进行， 可快速降低粘度， 不会产生甲醇和半乳糖醛酸。 里氏木霉来源的果胶裂解酶与黑曲霉来源的果胶裂解酶的使用效果比较1、里氏木霉来源的果胶裂解酶与黑曲霉来源的果胶裂解酶在果蔬汁及其饮料中的使用效

6、果对比资料与黑曲霉（包括重组黑曲霉）来源的果胶裂解酶相比，本品有诸多优势（具体试验报告见 附件 1），如下：作用时间更短， 可以更快的降低果汁粘度，加快过滤速度， 提高出汁率及产品澄清度，特别适用于需要快速降低粘度的产品加工（如橙汁加工）；使用本品的产品具有更好的压榨性能，缩短了加工时间， 有效提高了生产能力，有利于降低生产成本、提高生产效益；使用本品的产品中甲醇的含量更低；使用本品的产品具有更好的质量稳定性，有效延长了保质期。表 1 不同来源的果胶裂解酶在果汁中的应用效果对比果胶裂解酶果胶裂解酶指标（里氏木霉）（黑曲霉）酶作用机理反式消去作用反式消去作用作用条件更宽比较有限作用条件要求（ p

7、H 值： 3.0-6.0 ）（ pH 值： 3.0-4.5 ）酶活性作用速度30 秒210 秒（粘度降至30%）粘度降至初始水平的 27%降至初始水平的 78%30s 内）（作用时间出汁率93.5%92%甲醇含量0.2-0.3%1.5-2.0%NTU （ 12°BX ）0.782.6产品质量60%50%透光率（榨机出来的浊汁）浊度变化（ NTU ）+0.38+1.0稳定性色值变化（ 37保温 7 天）-40%-50%保质期3 年2 年榨机充填量（吨 /时）13-1410-12生产能力产能（吨 /时）98能耗更低普通2、里氏木霉来源的果胶裂解酶与黑曲霉来源的果胶裂解酶在果酒中的使用效果

8、对比资料略，涉及保密内容。3、里氏木霉来源的果胶裂解酶与黑曲霉来源的果胶裂解酶在果泥中的使用效果对比资料略，涉及保密内容。4、里氏木霉来源的果胶裂解酶与黑曲霉来源的果胶裂解酶在葡萄酒中的使用效果对比资料略，涉及保密内容。 在拟添加的食品中添加与否的效果对比略，涉及保密内容。 本品给食品加工业带来的进步性变化作为世界四大酶制剂之一，果胶裂解酶已被广泛应用于果蔬加工、酿酒、茶与咖啡发酵、榨油以及天然产物的提取等食品行业中。作为食品用酶制剂，果胶裂解酶可以快速降解果胶物质，降低原料加工难度、提高营养价值、改善产品质量及贮藏稳定性。食品工业作为中国国民经济的支柱产业之一，随着其持续、快速的发展，果胶裂

9、解酶的市场空间迅猛增长，需求巨大。但是，目前国内食品级果胶裂解酶主要来源于黑曲霉，来源单一、产率低、活性有限等问题已成为制约其产业化及应用的技术瓶颈之一，产量和功能远远不能满足国内日益增长的食品工业市场需求。作为世界上最早成立（ 1907 年）且最为知名的酶制剂公司之一，ABEnzymesGmbH自 1990 年就开始了果胶裂解酶的研究。研究发现里氏木霉具有表达量大、胞外蛋白质分泌率高和无毒、无害等特性， 是理想的异源重组蛋白表达宿主。公司利用基因工程技术，构建了高效的果胶裂解酶分子改良和表达技术体系，实现了黑曲霉果胶裂解酶基因在里氏木霉菌株的高效、安全表达，不仅拓展了果胶裂解酶的安全来源、提

10、高了酶活性，同时降低了生产能耗和成本，有利于提高其市场竞争力，推动果胶酶产业的发展，从而满足食品工业的巨大需求。 国外批准使用现状如本文所述，里氏木霉来源（包括转基因）的果胶酶已得到国际食品界认可。澳新食品标准局已批准里氏木霉来源的果胶酶作为食品加工助剂使用，参见澳大利亚新西兰食品标准法典第条-加工助剂，网址如下：。本次申请的果胶裂解酶（源于里氏木霉） ，已于 2000 年 4 月通过美国 FDAGRAS 认证（RAS/NoticeInventory/ucm265974.pdf ），作为无需限制使用的安全食品添加剂，用于果蔬、谷物和咖啡等的加工。以本品为主要成分的果胶裂解酶制剂自 1995 年

11、开始在欧洲各地销售，自 2000 年开始在美国销售，现已得到广泛的安全性应用，深受食品加工业的普遍欢迎， 年销售收入达 8 千万人民币， 客观证明了果胶裂解酶在食品生产中的安全、 有效和广泛需求。 迄今为止， 尚未发现任何与安全有关的案例。另外，本品果胶裂解酶已向欧盟委员会递交申请， 作为食品酶制剂用于果蔬、果酒、咖啡以及谷物加工，预计在年内将获得欧盟批准上市。鉴于中国巨大的市场潜力， 本公司特向中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会递交申请，批准其作为食品用酶制剂用于果蔬、葡萄酒等的加工。 产品已发表的相关文献Olempska-Beer 等人 1 （2006）在发表的文章中 ,对本次申请的果

12、胶裂解酶的批准状况进行了综述。（四）质量规格要求、 生产使用工艺和检验方法，食品中该添加剂的检验方法或者相关情况说明 质量规格编制说明1、标准编制依据本果胶裂解酶产品的质量规格符合联合国粮农组织和世界卫生组织的食品添加剂联合专家委员会（ JECFA）和美国食品化学制品药典（ FCC）关于食品用酶制剂的的规定， 同时也符合我国关于食品用酶制剂的相关要求。 产品质量规格的制定主要参考了以下国际 /国内标准：JECFA：食品加工用酶制剂通用标准；FCC 第 7 版：酶制剂的一般要求和额外要求；GB25594-2010食品安全国家标准食品工业用酶制剂；卫生部 2009 年 11 号公告：关于公布食品添

13、加剂新品种的公告 （果胶裂解酶）。质量规格中酶活性的检验方法按照附录A 的方法执行。2、与国际组织和其他国家（地区）相关标准的比较目前，国际上还没有以该重组里氏木霉为来源的果胶裂解酶产品的相关标准，因此没办法做对比。 质量规格要求名称：果胶裂解酶Pectinlyase来源：里氏木霉 Trichoderma reesei供体：黑曲霉Aspergillus niger1、生产工艺以转基因里氏木霉生产菌在严格控制的条件下进行液体深层发酵制备而成的果胶裂解酶。2、性状棕色液体，产品颜色随批次不同略有不同。3、 技术指标 理化指标应符合表 1 规定。表 1理化指标项目指标酶活性 /( PTF/mg)10

14、0重金属 /(mg/kg)30铅 /(mg/kg)5砷 /(mg/kg)3真菌毒素不得检出备注：酶活性规格除以上规格外，还可按实际需要执行。 微生物指标应符合表 2 规定。表 2微生物指标项目指标菌落总数 / (cfu/g)50000大肠菌群 /(MPN/g)30沙门氏菌 /25g不得检出致泻大肠埃希氏菌 /25g不得检出抗生素活性不得检出生产菌不得检出附录 A吸光光度法测定果胶裂解酶活性1、适用范围此方法适用于测量果胶酶中果胶裂解酶的活性。2、定义在试验条件下，以每分钟在 235nm 波长下吸光度增加 0.01 为 1 个果胶裂解酶活性单位，通常用 PTF/mg 来表示。3、试剂本方法中所用

15、水为去离子水、 超纯水；所用试剂在没有注明其他要求时， 均指分析纯试剂。 柠檬酸磷酸盐缓冲溶液（pH=5.8）称取 35.6g 磷酸氢二钠二水合物 (Na2HPO4·2H2O)，用容量瓶定容至1000mL。称取 21g 一水柠檬酸，用容量瓶定容至1000mL。在测试当天将上述溶液以57:43 的比例混合，检测 pH=5.8。通过添加上述其中一种溶液调整pH 值。 0.5%果胶基质溶液称取 5g 果胶（哥本哈根果胶）至烧杯中，加入20ml 纯乙醇或者96%浓度的乙醇，然后使用电磁搅拌器混合均匀。缓慢加入（2 分钟内） 800mL 的上述缓冲液，继续搅拌30 分钟（不要产生泡沫） 。调节

16、 PH 值至 5.8 后，用缓冲液定容至 1000mL。以 12000rpmm 的速度离心 10 分钟。基质在 -20凝固存储。在冷冻前应检查溶液吸收率（应该为 <2）。4、仪器和设备 分析天平 电磁搅拌器 分光光度计，如 UV-1601 离心机5、分析步骤 待测酶液的制备称取 200-500mg 样品用柠檬酸磷酸盐缓冲剂稀释，全部移入容量瓶中，定容。吸光度的变化应为 0.01-0.03（理想值为 0.02-0.03）每分钟。在每份样品中准备 3 份相同的重量。 测定设置分光光度计相关参数，用水溶液调零。用移液器吸取3.0ml 基质溶液到比色皿中并在 30下预热 15 分钟。然后加入 1

17、00 l 待测酶液，封口，翻转混合。在 235nm 波长下测定 8 分钟内的吸收率变化。6、计算在线性范围内（至少长达5 分钟）测量吸收率的增加。A= 吸收率的差异m=溶液中样品的数量（ mg）t=时间（ min）请知悉：岛津 UV-1601 测量 A/t 的数值。上述酶活性检验方法的方法学验证报告详见附件 2。 生产工艺果胶裂解酶的生产工艺，包括发酵、纯化（回收）、配制以及成品的质量控制。本节描述本产品生产中所应用的各种生产工艺。注：1.流程控制图中的控制步骤可能会根据生产过程中产品生产计划而有所变动。2.微生物控制：通过显微镜和平板计数确保无微生物污染。3.发酵过程中的参数例如pH 、温度

18、、氧气、二氧化碳、无菌空气的流通是受监测的。4.后处理过程中的操作控制包括监测和控制参数例如pH 、温度控制以达到质量评价中释放的标准。5.检验产品是否符合质量标准。1、发酵果胶裂解酶是通过转基因里氏木霉深层发酵制备生产的。 发酵原料只有检验合格的原料才可用于生产。发酵工艺（种子培养、种子罐、主发酵及补料）中所使用的原料如下所列：饮用水碳源氮源盐类和矿物质（硫酸铵、磷酸二氢钾）pH 调节剂泡沫控制剂 发酵环境的控制所有设备均经过谨慎的设计与构建，以阻止外源微生物的污染。所有发酵工艺中未使用的阀门和连接装置，均在 120以上的蒸汽中密封保存。高压灭菌后，发酵罐内维持一定的正压力。将通气用空气通过

19、无菌过滤器，对其进行灭菌。在每个发酵工艺前，清洗每个发酵罐的内侧。所有发酵罐、容器和管道使用后用在线清洁系统（ CIP）进行冲洗，并在清洗过程完成后进行检查。 菌种保藏生产菌株的培养物在甘油中于-80保存。接种之前，生产菌株的原种培养物按照下列参数进行质量控制：菌种确认、无污染微生物、活菌计数、产酶能力。 接种物将生产菌的培养物混悬液以无菌方式转移到含发酵培养基的摇瓶中。为了获得足够的生物量， 重复该流程数次。 获得足够的生物量之后， 合并摇瓶内容物用于接种种子发酵罐。 种子发酵接种物以无菌方式转移到试点发酵罐中，随后再转移到种子发酵罐中。 在恒定的温度和固定的pH 下进行种子发酵。 主发酵种

20、子发酵罐培养物经无菌操作转移至主发酵罐中， 通过标准的深层发酵法在主发酵罐中进行发酵。在主发酵过程中， 生产菌株进行果胶裂解酶的生物合成。 发酵流程应该持续到预定的时间，或者直到实验室检测数据显示已经获得理想的酶产量或者酶的生产速率已经降低到预定的生产速率以下。满足这些条件时，发酵结束。主发酵的控制参数如表3 所示。表 3主发酵罐工艺操作控制参数操作培养基灭菌蒸汽喷射灭菌（ 121°C，至少20 分钟）培养基测量 pH 值，需要时调节pH 值灭菌后分析温度在明确的温度下发酵通气培养基由灭菌空气通气压力保持发酵罐中的正压力发酵pH 值控制并调节CO2始终检测分析pH 值每隔一段时间测定

21、一次酶活力每隔一段时间测定一次微生物分析在接种之前和发酵过程中， 样品要严格控制微生物控制步骤中， 必须控制外源性微生物的量。 从种子发酵罐和主发酵罐中取样（接种之前、培养过程中定期、转移或收集之前），进行显微镜检查或平板计数分析。同时密切监测相关发酵参数，如酶活力和pH 值，偏离正常的发酵工艺可能意味着有染菌。2、回收回收的目的在于从发酵液中分离出所需要的酶，然后对酶进行纯化、浓缩。本工艺步骤包括一系列单元操作，包括预处理、固液分离、浓缩、抛光和细菌过滤。不同酶生产厂家，该单元操作的性质、数量和顺序可能各不相同。 回收原料回收工艺中所使用的原料如下所列：? 絮凝剂? 助滤剂? pH 调节剂回

22、收流程中除了上述材料之外还可以使用饮用水。 预处理如果需要时，可加入絮凝剂或助滤剂以方便初步分离过程。 助滤剂的用量通常为 2.5%。 固液分离通过离心或过滤等技术，将细胞群和其他固形物从发酵液中分离去除。工艺中使用的助滤剂为食品级硅藻土。在规定的 pH 和温度范围内进行固液分离，以便最大限度地减少酶活性的损失。 浓缩使用超滤和蒸发对酶进行浓缩和进一步纯化， 以获得期望的酶活性、 增加活力 /干物质比。在浓缩过程对温度和pH 进行控制，直到获得所需的浓度。 抛光和细菌过滤为了去除残留的生产菌并作为一般性的防微生物降解措施， 使用专用的微生物过滤器进行过滤。预过滤（抛光过滤）为可选项，可用于清除

23、不溶性杂质并促进细菌过滤。该单元操作可以去除生产菌及其他来自发酵的不溶性杂质。3、配制和包装依据产品质量标准，配制标准化酶制剂产品。4、产品控制分析每批产品以确保果胶裂解酶制剂的质量。产品控制标准包括 pH、酶活性、微生物纯度等。 该食品添加剂在食品中的生产使用工艺根据不同食品生产工艺和工序使用该酶制剂。 下面给出了果胶裂解酶用于果蔬汁、葡萄酒、果酒、果泥加工过程的工艺流程图供参考。1、果胶裂解酶在果蔬汁中的生产使用工艺果胶裂解酶及其它果胶酶的复合酶制剂通常用于果蔬加工。 在对原料进行处理时，可用于果实脱皮；在处理果浆时，可有效降低黏度、改善压榨性能，提高出汁率和营养成分含量； 在进行沉淀、 过滤和离心时， 可破坏果汁中悬浮的稳定性，提高超滤的通量，缩短超滤时间，降低非酶褐变，稳定果汁，保证良好的贮存稳定性和质量要求。 由于果胶裂解酶可