RT-PCR详细图文解析

1、、头“火龙ITE里PCR原理.(一)定义：在 PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。(二)实时原理1、常规PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩 增反应实时检测。2、实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测 PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析3、如何对起始模板定量?通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析4、几个概念:(1)扩增曲线受光松图元件扩增曲线图:嘴坐标:扩增懵环数(Cv'cle):纵空

2、标：荧光强度每个循环进行一次荧光信号的收集(2) 荧光阈值:(3) Ct值:荧光信号阐值(threshold )： 前15个循环信号作为黄光本底信号 (baseline?,即样本的灵光背景值和阴性对照的荧光值 荧光域值的缺省设置是315个循环 的荧光信号的标准僻差的10倍 手动设置工原则要大于样本的荧光背 景值和阴性对照的灵光高值，同时要尽 量选择进入指数期的最初阶段,并且保证 回归系数大于099 真正的信号:荧光信号超过域值Ct值的定义：PCR犷增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈 值时所经过的扩增循环次数CT值的重现性:纵轴：关光信号量横轴PCR反映86球薮Ct值的特点工相同模板进行9

3、漱扩增，终点处产物量不恒定1-Ct值则极具重现性5、定量原理:理想的PCR反应：X=X0*2n非理想的PCR反应：X=Xo (1+Ex) n n：扩增反应的循环次数X：第n次循环后的产物量Xo：初始模板量Ex：扩增效率 5、标准曲线模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小 Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品 可作出标准曲线，根据样品Ct值,就可以计算出样品中所含的模 板量6、绝对定量1）确定未知样品的 C值2）通过标准曲线由未知样品的C值推算出其初始量7、DNA的荧光标记:非特异性荧光标记：1、SYBR Green特异性荧光标记：、工殁Man咕夕3、Mol

4、ecular Beacon （二、实时荧光定量 PCR的几种方法介绍方法一：SYBR Green 法（一）工作原理1、SYBR Green 能结合到双链 DNA的小沟部位2、SYBR Green只有和双链DNA结合后才发荧光3、变性时，DNA双链分开，无荧光4、复性和延伸时，形成双链DNA, SYBR Green发荧光，在此阶段采集荧光信号黄光强匹Tm值：DNA解链一半时的温度将温度与荧光强度的变化求导口（-d"dT）融解曲纥分析.皿一吓 无非特异性荧光 定盘准确融解曲段分析 土睨杂里其他户期出现非特异性焚 光，因此定置不准确.模板DNA量越多.荧光达到域值的循环数越少 Log浓度与

5、循环数呈线性关 系，根据样品Ct值,就可以计算出样品中所含的模板量PCR反应体系的建立及优化：1、SYBR Green使用浓度：太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测2、Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准3、MgCl2的浓度：可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物4、反应Buffer体系的优化5、反应温度和时间参数：由酶和引物决定6、其他与常规 PCR相同(二)应用范围1、起始模板的测定；2、基因型的分析；3、融解曲线分析：可以优化 PCR反应的条件，对常规 PCR有指导意义，如对 primer 的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。(三)

6、优点及缺点优点：对DNA模板没有选择性；适用于任何 DNA;使用方便；不必设计复杂探针； 非常灵敏；便宜。缺点：容易与非特异性双链 DNA结合，产生假阳性；但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件；对引物特异性要求较高。方法二：TaqMan- 水解型杂交探针Probe索 Reporter Quencher与目标序列互补*5端标记有报告基团(Reporter, R),如FAM、VIC等* *3 '端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)* *探针完整，R所发射的荧光能量被 Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光* *Taq酶有5' 3'外切核酸酶活性，可水解探针（一）工作原理注意：每扩增一条 DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光PCR反应的建立：1、引物、探针的设计：探针Tm为68-70 C , <30 bp, 5不能有G, G可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针，扩增片段<400 bp ,引物Tm为59-60 C2、反应参数的确定：一般为：94 C, 10-20S60 C, 30-60S （Taq酶5'>3'外切核酸酶活性在 60 C 最高）也可通过温度梯度优化退火温度72 C, 45 S,3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，彳t号/背景比值的最大值引物浓度：50-900nM探针浓