生物化学10DNA的复制和修复

1、dnA勺复制和修复现代生物学充分证明 DN端生物遗传的主要物质基础。生物机体的遗传信息以密码的形 式编码在DNA子上，表现为特定的核甘酸序列，并通过DNA勺复制由秦代传递给子代。在后代的生长发育过程中，遗传信息自DNA专录给RNA然后翻译成特异地蛋白质，以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。所谓复制，就是指原来 DN册子为模板合成出相同分子的过程，所谓转录，就是在 DNA分子上合成出与其核甘酸顺序相对应的RNA勺过程所谓翻译，就是在RNA勺控制下，根据核酸链上的每三个核酸决定一个氨基酸的三联体 密码规则，合成出具有特定氨基酸顺序的蛋白质肽链过程。在某些，f#况下 RNAfe可以

2、是遗传信息的基本携带者，例如，RNAW毒能以自身核酸分子为模板进行复制，致癌 RNAW毒还能通过逆转录的方式将遗传信息传递给DNADNA勺复制原核生物每个细胞只含有一个染色体，真核生物每个下拨常含有多个染色体。在细胞增殖周期的一定阶段整个染色体组都将发生精确的复制，随后以染色体为单位把复制的基因组分配到两个子代细胞中。染色体DNA勺复制和细胞分裂之间存在密切的相互联系。一旦复制完成，就可发动细胞分裂，细胞分裂结束后，又可开始新一轮DNAM制。线粒体和叶绿体的 DNA可用以编码自身的rRNA和t RNA以及一小部分蛋白质，其他的 蛋白质则由核基因编码，并在液泡合成后再运进细胞器。细胞器DNA的复

3、制并不限于核 DNA的合成器，而可在整个细胞周期进行。对于某个DNA分子来说，进入或不进入复制是随机的，因为有些DN所子在细胞周期中复制不止一次，有些则不发生复制，然而就总体来说，每一细胞周期中细胞器 DNA勺总量将增加一倍，从而保 持了每个细胞的细胞器 DNA数量恒定。由于DNA遗传信息的载体，在合成DNAM,决定其结构特异性的遗传信息只能来自其 本身，因此必须由原来存在的分子为模板来合成新的分子，即进行自我复制。DNA的双链结构对于维持这类遗传物质的稳定性和复制的准确性都是极为重要的。DNA勺半保留复制DNA由两条螺旋的多核甘酸链组成，两条链的碱基通过氢键连接在一起。一条链上的核 甘酸序列

4、排列顺序决定了另一条链上的排列顺序。由此可见，DNA分子的每一条链都含有合成它互补链所必需的全部遗传信息。DNAM制时，母链的两股DNA军开成两股单链，各自作为模板指导子代合成新的互补链。 子代细胞的DNA双链，其中一股单链从亲代完整的接受过来，另一股单链则完成重新合成。 两个子代细胞的 DNAZ链，都和亲代母链的 DNA碱基序列一致。此即 DNA的半保留复制。1958年Meselson和stahl利用氮的同位素15N标记大肠杆菌 DNA首先证明了 DNA的 半保留复制。他们让大肠杆菌在以15NH 4cl作为唯一氮源的培养基中生长，连续生长1 2代，从而使所有DNA分子标记上15N。15N-D

5、NA的密度比普通14N-DNA的密度大，在氯化葩密度 梯度离心时，这两种 DNAt归形成不同的区带。如果将 15N标记的大肠杆菌转移到普通培养基 中培养（含14N的），经过一代后，所有的 DNA密度都介于15N-DNA和14N DNA之间，即形 成DNA分子一半含14N , 一半含15N。两代后，14N和14N - 15N杂合分子等量出现，若再培养， 可以看到14N -DNA分子增多。当把14N-15N杂合分子加热时，它们分开成 15N链和14N链。这 就充分证明了，在DNA复制时原来的DNA分子可被分成两个亚单位，分别构成子代分子的一 半，这些亚单位经过许多代复制后仍然保持着完整性。在这以后

6、，用许多种原核生物和真核生物复制中的DNA做了类似的实验，都证实了 DNA复制的半保留方式，然而这类实验所研究的复制中的DNAS提取过程中已被断成了许多片段，得到的信息只涉及 DNAM制前和复制后的状态。1 9 6 3年 Cairn用放射自显影的方法第一次观察到完整的正在复制的大肠杆菌染色 体DNA他将3H脱氧胸背标记大肠杆菌 DNA然后用溶菌酶把细胞壁消化掉，使完整的染色体DNA释放出来，铺在一张透析膜上，在暗处用感光乳胶覆盖于干燥了的表面上放至若干星期。在这期间3H由于放射性衰变释放出离子，使乳胶曝光生成银粒。显影后银粒黑点轨迹勾画出DNA分子的形状，黑点数目代表了 3H在DN6子中的密度

7、。把显影后的片子放在 光学显微镜下，姐可以观察到大纲杆菌染色体的全貌。用这种方法，Cairns阐明了大肠杆菌染色体DNA一个环状分子，并以半保留的方式进行复制。半保留复制，即子代 DNA分子中仅保留一条亲代链，另一条链是新合成的，这是双链 DNA1遍的复制机制。即是单链 DNA子，在其复制过程中也通常总是要线形成双链的复制 型式(RF)。半保留复制要求亲代 DNA勺两条链解开，各自作为模板，通过碱基配对的法则， 合成出另一条互补链。所谓模板即是能提供合成一条互补链所需精确信息的核酸链。在这里，碱基配对是核酸分子间传递信息的结构基础。无论是复制、转录或逆转录，在 形成双链螺旋分子时都是通过碱基配

8、对来完成的，需要指出的是，碱基、核昔或核甘酸单体之间并不形成碱基对，但是在形成双链螺旋时由于空间结构的关系而构成特殊的碱基对。DNA的半保留复制机制可以说明DNA在代谢上的稳定性，经过许多代的复制，DNA勺多核甘酸链仍可保持完整， 并存在于后代而不被分解掉。DNA与细胞其他成分相比要稳定得多，这和它的遗传功能是相符的。但是这种稳定是相对的，DNA在代谢上并不是完全惰性的物质。在细胞内外各种物理、 化学和生物因子的作用下，DN心发生损伤，需要修复；在复制和转录过程中DNA也会有损耗，而必须进行更新。在发育和分化过程中，DNA勺特定序列还可能进行修饰、删除、扩增和重排。DNA复制的起点和终点基因组

9、能独立进行复制的单位叫做复制子。每个复制子都含有控制复制起始地起点(ori ),可能还有终止复制的终点。复制是在起始阶段进行控制的，一旦复制开始，它将 继续下，直到整个复制子完成复制。原核生物的染色体和质粒，真核生物的细胞器 DNATB是环状双链分子。 实验表明，它们都在一个固定的起点开始复制，复制方向大多是双向的，即形成两个复制叉或生长点，分别向两侧进行复制；也有一些单向的，只形成一个复制叉或生长点。通常复制是对称的， 两条链同时进行复制。DNAS复制叉处两条链解开，各自合成其互补链，在电子显微镜下可以看 到形如眼的结构，环状 DNA的复制眼形成希腊字母形结构。真核生物染色体DNA线性双链分

10、子，含有许多复制起点，因此是多复制子。通过放射自显影的实验可判断 DNA复制是双向进行的，还是单项进行的。在复制开始时， 先用低放射性的3H -脱氧胸背标记大肠杆菌， 经数分钟中后，再转移到含有高放射性的 3H - 脱氧胸背培养基中继续进行标记。这样在放射自显图像上，复制器起始区的放射性标记密度较低，感光还原的银颗粒密度就较低；继续合成区标记大肠杆菌放射性标记密度较高，感光还原的银颗粒密度就较高。若是单向复制，银颗分布密度应是一端低，一端高。若是双向复制，则应是中间密度低， 两端密度高。由大肠杆菌所获得的放射自显图像都是两端密，中间疏，这就清楚证明了大肠杆菌染色体DNA双向修复的。大多数生物染

11、色体 DNA的复制是双向的，并且是对称的，然而也有例外。枯草杆菌染色 体DNA的复制虽是双向，但是两个复制叉移动的距离不同。一个复制叉仅在染色体上移动五分之一距离，然后停下等待另一复制叉完成五分之四距离。质粒R6K的两个复制叉的移动也是不对称的。有一种单向的特殊复制方式，称为滚动环。噬菌体 X174DNA是环状单分子，它在复制过程中首先形成共价闭环的双联分子（复制型）,然后其正链由A蛋白在特定位置切开，游离出一个3末端，A蛋白连在5末端。随后在 DNA聚合酶催化下，以环状负链为模板， 从正链的3 - OH末端加入脱氧核甘酸，使链不断延长，通过滚动合成出新的正链。合成 一圈后，露出切口顺序， A

12、蛋白再次将其切开，并连在切出的 5磷酸基末端，游离出单位 噬菌体环状单分子 DAN实验证明某些双链的 DNA合成也可以通过滚动环的方式进行。例 如噬菌体复制的后期。另一种单向复制的特殊方式称为取代环或D-环式。线粒体的DNAM制方式采取这种方式（纤毛虫的线粒体 DNA为线型分子，复制方式与此不同）。双链环在固定点解开进行复制， 但两条链的合成是高度不对称的，一条链先复制，另一条链保持单链而被取代。真核生物染色体 DNA的复制要比原核生物慢得多，这是由于真核生物的染色体具有复 杂的高级结构，复制时需要解开核小体，复制后又需重新合成核小体。综上染色体的复制方式有：1 .直线双向复制：单点双向（T7

13、）2 .多起点双向：真核染色体 DNA3 .滚环复制：环状单链 DNA X174DNA4 . D型复制：线粒体、叶绿体 DNA5 .多复制叉复制：第一轮复制尚未完成， 复制起点就开始第二轮的复制。在大肠杆菌营养丰富时，可采取多复制叉复制方式。DNAK应聚合有关的酶DNA由脱氧核糖核甘酸聚合而成。与DNA普核反应有关的酶包括多种DNA聚合酶和DNA连接酶。DNA5合酶1 9 5 6年Kornberg首先从大肠杆菌提取液中发现了DNA聚合酶。其后从广泛不同的生物中都找到这种酶。 有适量DN用口镁离子存在时，该酶能催化四种脱氧核糖核酸三磷酸合 成DNA所合成的DNAM有与天然DNAt目同的化学结构和

14、物理性质。d ATP dGTR dCTP和 dTTP四种脱氧核糖核甘酸三磷酸缺一不可；它们不能被相应的二磷酸或一磷酸化合物所取 代，也不能被核糖核甘酸所取代。在DNAm合酶催化下，脱氧核糖核甘酸被加到DNA链的末端，同时释放出无极磷酸。DNA聚合酶催化的链延长反应中，链的3羟基对进入的脱氧核糖核甘三磷酸的磷原子发生亲核供给，从而形成3 5 磷酸二酯键并脱下焦磷酸。形成磷酸二酯键所需要的能量来自 -与 -磷酸基之间高能磷酸键的裂合，聚合反应是可逆的，但随后的焦磷酸水 解可推动反应的完成。DNA由5 段向3 端方向延长。DNA聚合酶只能催化脱氧核糖核酸自身发生聚合，它需要引物链的存在，加入的核甘酸

15、则由模板链所决定。与生物小分子的合成不同，信息大分子的合成除了需要有底物、能量和酶外，还需要模板。DN臊合酶催化的反应是按模板的指令进行的，只有当进入的碱基能与模板链的碱基形 成WatsonCrick类型的碱基对时，才能在该酶催化下形成磷酸二脂键。因此，DNA聚合酶是一种模板指导的酶。加入各种不同生物来源的 DNA做模板，可以同样引起和促进新的 DNA勺酶促合成，而产物DNA的性质完全不取决于聚合酶的来源，也与四种核甘酸前体的相对比例无关，而仅仅取决于所加入的模板 DNA产物DNA乍为模板的双螺旋 DNAM有相同的碱基组成，这说明在DNA聚合酶的作用下，模板DN解口两条链都能进行复制。偎极的喇

16、物根梅的合成的引物锤押.枢*DNA聚合酶的反应可以利用双链 DNA乍为模板和引物，可以了利用单链DNA乍为模板和 引物。在单链DNA勺复制中，3 羟基末端通过链的自身回折成为引物链，其余未配对的链则为模板链，由此形成发夹环结构。双链DNA勺复制发生在切口、缺口或末端单链区。圉34-N 由DNA *介嵇漳化的仆感反应人.由线性单性ON A地打的反中*配由岫解宣或他疑的 孙成pna选打的拉龙* c-在n。卯U的值班UNA的俄应HJ rift 对5 3身卜切触水* 5幅展成出成分生讷UNA； 2做进行的成鹿*金怔-小蝴山细！Elt&冢；粘作出的川相综上所述，DNA聚合酶的反应特点为：1。以四种脱氧核

17、糖核甘三磷酸作为底物2.反应需要接受模板的指导3 .反应需要有引物3 羟基的存在4 .DNA链的生长方向为5-3 5.产物DNAI1生质与模板相同，这就表明了DNA聚合酶合成的产物是模板的复制物。各种不同类型的DN臊合酶大肠杆菌中共含有五种不同的DNA聚合酶，分别成为l、ll、lll 、IV、VDN咪合酶l反应时需要有引物链（DNAB1或RNAB1）是一个多功能酶，可以催化以下反应。1 .通过核甘酸聚合反应，使 DN颂沿着5方向到3方向延长（DN咪合酶活性）2 .由3 水解DNA链（3 一 5 核酸外切酶活性）3 .由5 水解DNA链（5 一 3 核酸外切酶活性）4 .由3 端发生焦磷酸解5

18、.无极焦磷酸盐与脱氧核糖核甘酸之间的焦磷酸基交换焦磷酸解释聚合反应的逆反应， 焦磷酸交换反应则是由前两个反应连续重复多次引起的。实际上DNA聚合酶l兼具3 一 5 核酸外切酶活性以及5 一 3 核酸外切酶活性DNA聚合酶被酶蛋白切开的大片段称为Klenow片段，呈右手结构，右手结构是核酸聚合酶的共同特征。模板核酸落入核酸聚合酶拇指结构和指形结的凹槽时，引起构象改变，从而使聚合酶能够握住核酸分子。聚合酶之所以能够辨认进入的底物核甘酸，因为凹槽空间只允许底物与模板之间形成符合配对原则的碱基配对。 非配对碱基因空间位置不合适而不能进行聚合反应，这就保证了新合成的链严格按照模板的互补碱基顺序进行聚合，

19、在这里，酶对底物进行了专一的核对，然而错配的碱基仍然不可避免的会出现。DNA聚合酶的3 -5核酸外切酶活性能切除单链DNA的3末端核甘酸，而对双链DNA不起作用，故不能形成碱基对的错配核甘酸可被酶水解下来。然而在正常聚合条件下，3-5核酸外切酶活性不能作用于生长链；若一旦出现错配碱基对， 聚合反应即停止，生长链的3 末端核甘酸落入3 - 5 外切酶位点，错配核甘酸迅速被除去，然后聚合反应才得 以继续进行下去。3 -5核酸外切酶活性被认为起着校对的功能，它能纠正聚合过程中的碱基错配。由此可见，DNA复制过程中碱基配对要受到双重核对：一是聚合酶的选择作用， 二是3-5核酸外切酶的校对作用。有了3

20、-5核酸外切酶校对，大大降低了错误率。3 -5 核酸外切酶的校对作用对 DNA复制的忠实性极为重要。如果没有这种活性，DNA复制的错误将大大增加，例如T4噬菌体突变率很高，从这种变异株得到的T4DNAm合酶中3 -5外切酶活性很弱，在DNAM制中非常容易出错误， 起着促突变因子的作用。（相对的， 就起到抗突变因子的作用）所以3 -5核酸外切酶活性对聚合酶的比值与DNA复制的准确性有关，进而影响到自然突变率。抗突变菌株的DNAm合酶虽然是高度保真的， 但在进化中未必优越，因为一定的自然突变率队生物的进化是必要的，若外切酶活性较强，甚至在聚合条件下失去对外切酶的抑制作 用，造成正常聚合的核甘酸不断

21、被切除，这是个耗能大，效率低的系统。DNA聚合酶1尚有5 3 外切酶活性，它只作用于双链 DNA勺碱基配对部分，从5 末端水解下核甘酸或寡核甘酸。因而该酶被认为在切除由紫外线照射而形成的喀咤二聚体中起重要作用。DNA半不连续合成中冈崎片段5端RNA引物的切除也有赖于这个外切酶。DN咪合酶1 1聚合酶1合成 DNA勺速度太慢，只及细胞DNAM制速度的百分之一。 其次，其持续合成 能力较低，细胞内DNA合成的复制不会频繁中断，另外遗传学分析表明许多基因突变都会影响DNA的复制，但和聚合酶l无关。通过对缺乏聚合酶 l的变异菌株发现其 DNA复制正常， 但是损伤的修复机制有明显的缺陷。由此直接表明，D

22、NA聚合酶l不是复制酶，而是修复酶。后来证明，在DNA复制过程中起着取代 RNMI物的作用，只是参与局部修复。聚合酶11为多亚基酶，酶活力比聚合酶1高，也是由四种脱氧核糖核甘三磷酸为底物， 从5 3方向合成 DNA并需要有缺口的双链 DNA乍为模板一引物，但缺口不能太大否 则酶活力将降低。反应需要镁离子和氨根离子激活。聚合酶1 1具有3 - 5 核酸外切酶 活性，但是无5 - 3 核酸外切酶活性。聚合酶1 1也不是复制酶，而是一种修复酶。聚合酶111聚合酶111也是由多个亚基组成的蛋白质，现在认为它是大肠杆菌细胞内真正负责从新和成的DNA勺复制酶。虽然每个大肠杆菌细胞中只有1 0 2。个聚合酶

23、1 1 1分子， 然 而它催化的合成速度达到了体内D N A合成的速度。聚合酶ll与lll基本性能是相同的：1.都需要模板的指导，以四种脱氧核糖核昔三磷 酸作为底物，并且需要有 3 -OH引物链存在，聚合反应按 5 -3方向进行2.他们都没有 5 -3外切酶活性，但都有 3 -5 核酸外切酶活性，在聚合过程中起校对作用3.它们都是多亚基酶，DNA聚合酶ll和lll共用了许多辅助亚基。聚合酶ll和聚合酶lll与聚合酶l相比有明显的区别：聚合酶ll和聚合酶lll最宜作 用于带有小段缺口的双链 DNA而DNA聚合酶l最宜作用于具有大段单链区的双链DNA甚至是带有很短引物的单链 DNA它们的聚合速度、

24、持续合成能力均有很大不同，反映了它们 功能的不同。聚合酶1 V和V这两种酶涉及DNA勺错误倾向修复。当DNAg到较严重损伤时，即可诱导产生这两个酶， 但修复缺乏准确性，因而出现高突变率。DNAS接酶DNA聚合酶只能催化多核甘酸链的延长反应，不能使链之间连接。环状DNA的复制表明，必定存在一种酶，能催化链的两个末端之间形成共价连接。即 DNAB1接酶，其能催化双链 DN砌口处的5磷酸基和3羟基生成磷酸二脂键。连接反应需要供给能量，大肠杆菌和其他细菌的DNA连接酶以烟酰胺腺喋吟二核甘酸（NAD作为能量来源，动物细胞和噬菌体的连接酶则以腺胺三磷酸（ATP）作为能量来源大肠杆菌DNA链接酶要求断开的两

25、条链由互补链将它们聚在一起，形成双螺旋结构。它不能将两条游离的 DN6子连接起来。DNA勺半不连续复制在体内，DNA勺两条链都能作为模板合成出两条新的互补链。但是由于DN册子的两条链是反向的。DN咪合酶的合成方向都是 5 -3,这就很难说明DNA复制时两条链如何作 为模板合成其互补链。所以日本学者冈崎提出了 DNA的半不连续复制模型。认为 3 -5走向的DNA实际上是 由许多5 -3方向合成的DNA段连接起来的。冈崎用3H -脱氧胸背标记噬菌体 T4感染的大肠杆菌，然后通过碱性密度离心法分离标 记的DNA产物，发现短时间内首先合成的是较短的DNM段，接着出现较大的分子， 最初出现的DNA片段长

26、度约为1000个核甘酸左右，一般称为冈崎片段。用DNA连接酶变异的温度敏感株进行实验，在连接酶不起作用的温度下，便有大量DNM段积累。这说明在DN限制过程中首先合成较短的片段，然后由DNA!接酶连成大分子。这也就是不连续合成。DNA的不连续合成不只局限于细菌，真核生物染色体的DNA复制也是如此。不过冈崎的实验并不能判断 DNA链的不连续合成只发生在一条链上，还是两条链都如此，对冈崎片段进行测定， 其数量远远超过新合成的 DNA的一般，似乎两条链都是不连续的。后来发现这是由于尿喀咤代替胸腺喀咤掺入DNA所造成的。DNA中的尿喀咤可被尿喀咤一DNA-糖甘酶切除，随后该处的磷酸二脂键断裂，一些核甘酸

27、被水解，造成一个缺口，最后缺口空 袭被填补和修复，在此过程中也会产生一些类似冈崎片段的DNM段。用缺乏糖甘酶的变异菌株进行实验，DNA的尿喀咤将不再被切除，此时新合成的DNA大约有一半放射性标记出现于冈崎片段中，另一半直接进入大的片段。由此可见，DNAM制时，一条链是连续的，另一条链是不连续的，此即半不连续复制。以复制叉向前移动的方向为标准，一条模板链是3 一 5 走向，在其上 DNA能以5 3 方向连续合成，成为前导链；另一条模板链是5 3走向，但是在其DNAh也是从5 -3 合成，但是与复制叉的移动方向是相反，随着复制叉的移动，形成许多不连续的 片段，最后练成一条完整的 DNA1,该链称为

28、滞后链。由于DNAM制酶系不易从 DNA模板上解离下来，因此前导链的合成通常是连续的。 但是 有很多因素会影响前导链的连续性， 例如模板链的损伤、复制因子和底物供应不足，都会引 起前导链复制中断并从另一新起点开始。RNMI 物DNA聚合酶不能发动新链的合成，只能彳t化已有的链的延长反应。RNAm合酶则不同，它只需要DNA莫板存在，就可以在其上合成出新的RNA链。所以DN蛤成需要引物，RNA合成不需要引物。冈崎片段是新合成的链，它是如何开始的，引物又是什么？现在知道DNA模板上需要先合成一段 RNA引物，DNAm合酶从RNA引物的3 O廊开 始合成新的DNA链。冈崎片段的合成除了需要四种脱氧核糖

29、核甘酸外，还需要四种核糖核甘酸。新合成的DNA段上共价连接着一段小 RNA。专一的水解酶证明，RNA链位于DNA片段的5 末端。RNA引物是在DNA莫板链的一定部位合成并互补于DNAK,合成方向是5 -3,催化该酶的反应是引物合成酶（该酶作用时酶与另外6种蛋白质结合形成引发体）。引物的长度通常为几个核甘酸至十多个核甘酸，DNA聚合酶111可在其上聚合脱氧核糖核甘酸，直至冈崎片段的合成。RNA引物的消除和缺口的填补是由 DNA聚合酶1来完成的，最后由 DNA连接 酶将冈崎片段练成长链。生物体之所以要用如此复杂的机制去复制DNA主要是为了保持DNAM制的高度忠实性，生物体的自发突变都是由 DNA复

30、制时碱基对的错配引起的。DN咪合酶对底物的选择作 用以及3 - 5 外切酶的校对作用使错配概率大大降低，在体内结构下，其复制的复杂结构进一步提高了复制的准确性；修复系统可以检查出错配碱基和DNA种损伤并加以修复。DNA聚合酶之所以要有引物的存在即不能从无到有合成新的链是因为在未核实前一个核甘酸处于正确配对状态，是不会进行聚合反应的。RN咪合酶没有校对功能，因此不需要引物，RNMI物都是从新开始合成的，它的错配可能性大，在完成引物作用后DNA聚合酶1将其删除，而代之以高保真的DNAB1。DNA复制的拓扑性质（未整理，P419）DNA勺复制过程DNA复制过程可分为三个阶段：起始、延伸和终止。其间的

31、反应和参与作用的酶和辅助 因子各有不同。在DNA合成的生长点，即复制叉上，分布着各种各样与复制有关的酶和蛋白 因子，它们构成的复合物称复制体。DNAM制的阶段表现在其复制体结构的变化。复制的起始大肠杆菌复制的起点称为 oriC ,由245个bp（碱基对）构成，其序列和控制元件在细菌复制点中十分保守。 关键序列在于两组段的重复：三个13bp的序列和四个9bp序列（DnaA蛋白结合位点）。正如上面所说大肠杆菌起点复制包括多种酶和辅助因子。Dna蛋白各带一个 ATP结合在此位点上，并聚集在一起，DNA绕其上，形成起始复合物。整一上大题杆超点与*起始有关的与餐财国于量白旃相时处于质邛曜敷目确 能A52

32、 000t机制起点序月.在起京桂异位产书Dm B300 (MX)6解开DN4亚链(Jud C29 DOOJ切勘Dm B结合于起点HU司DUO2美租猫向出:玷合第白道起始弓1婢0成.瞬Ena G）6nom1合成RNA引物彼 DFfA 站合 JitKSSfi)75 004怙含单凝DNAUNA ff 合 Bfc4M 0005盘进曲N抬性口号总转IW（拓扑异构的n）400 0004野放1族.“解例加程产中的和曲张力甲基比随Uuu生虺总G凡代序列的唳噎畛甲基比HU蛋白可与DNA吉合，促使双链 DNAf曲。DanB借助水解ATP产生的能量，沿着 DNA链5 3方向移动，解开DNA的双链，此时称为前引发复合

33、物。DNA双链的解开还需要 DN颇转酶（拓扑异构酶ll ）和单链结合蛋白（SSB ,前者可以 消除解螺旋酶产生的拓扑张力，后者保护单链并防止恢复双链。至此引物合成酶合成 RN阿物，并开始 DNA的复制。复制的起始要求 DNA呈负超螺旋，并且起点附近的基因处于转录状态，这是因为DnaA只能与负超螺旋的 DN曲目结合。RNA聚合酶对复制起始的作用， 可能是因其在起点邻近处合成一段RNA形成RNA突环，影响起点的结构，因而有利于DnaA的作用。DNAM制的调节发生在起始阶段，一旦开始复制，如无意外受阻，就能一直进行到完成。DNA复制的发动与DNA甲基化以及细菌质膜白相互作用有关。Dam甲基化酶可以使

34、起始序列中的腺喋吟的第六位N甲基化。DNA完成复制后，大肠杆菌的亲代链依然保持着甲基化，而新合成的链未甲基化，因此是半甲基化的DNA半甲基化的起点不能发生复制的起始，直到Dam甲基化酶使起点完全甲基化。甲基化的延迟可能是因为 oriC与膜结合而阻碍了 Dam甲基化酶的作用。 复制的延伸复制的延伸阶段同时进行前导链和滞后链的合成。这两条链合成的基本反映相同，并且 都由DNA聚合酶111催化。但两条链的合成也有明显差别前者持续合成，后者分段合成。因此参与的蛋白质因子也有不同亲代DNAT先必须由DNA军旋酶将双链解开，其产生的拓扑异构张力由拓扑异构酶释放， 分开的链被单链结合蛋白所稳定。自此之后，前

35、导链与滞后链的合成便有所不同复制起点解开后形成两个复制叉，既可进行双向复制。前导链开始合成后通常都一直继续下去。先由引物合成酶（ DnaG蛋白）在起点处合成 一段RNA引物，前导链的引物一般比冈崎片段的引物略长一些，大约10-60个核甘酸。随后DN咪合酶1 1 1在引物上加入脱氧核糖核甘酸，前导链的合成与复制叉的移动保持同步。滞后链的合成是分段进行的，需要不断地合成冈崎片段的RNA引物，然后由DNA聚合酶111在引物上加入脱氧核糖核酸。为了使前导链与滞后链的合成协调一致，即被同一个DNA聚合酶lll二聚体所合成，滞后链必须绕成一个突环。合成冈崎片段需要 DNA聚合酶1 1 1不断与模板脱开，然

36、后在新的位置上又与模板结合。这一作用是 夹子和 复合物来完成的。DnaB有两个功能，其一是解螺旋酶，以解开DNA的双螺旋；另一活化引物合成酶，促进其合成RNA引物。由DnaB解螺旋酶和Dna引物合成酶构成了复制体的一个基本功能单位称为引发体。无 论哪一种引发体，都能依赖ATP沿着复制叉运动方向在DNA链上移动，并合成冈崎片段的RNA引物。引物的合成方向与复制叉的前进方向正好相反。DNA聚合酶1 1 1在模板链上合成冈崎片段，遇上一个冈崎片段时即停止合成，亚基随即脱开DNAB1,可能正是此停顿为合成 RNA引物的信号。复制的终止细菌环状染色体的两个复制叉向前推移，最后在终止区相遇并停止复制，该区

37、含有多个约2 2b P的终止子位点。大肠杆菌有六个终止子位点，分别称为terA terF，与t e r位点结合的蛋白值成为T us。Tus - t e r复合物只能阻止一个方向的复制叉前移，即不让对侧复制叉超过中点后过量复制。在正常情况下，两个复制叉前移的速度是相等的，到达 终止区后就停止复制。DNA聚合酶l通过5 -3外切酶活性切除 RNA引物并完成缺口处 DNA制。DNA1接 酶封闭DNA1上切口。真核生物DNA的复制（未吸整理）真核生物的DNA常都与组蛋白构成核小体，以染色质的形式存在于细胞核中。DNA勺损伤修复DNA在复制过程中可能产生错配。DNAM组、病毒基因的整合，常常会局部破坏D

38、NA的双螺旋结构。某些物理化学因子，如紫外线、电离辐射和化学诱变剂等，都能作用于DNA造成其结构与功能的破坏，从而引起生物突变，甚至导致死亡。然而在一定条件下，生物机 体能使其DNA勺损伤得到修复。这种修复是生物在长期进化过程中获得的一种保护功能。造成DNAg伤的原因可能是生物因素、物理因素或是化学因素； 可能来自细胞内部， 也可能来自细胞外部；受到破坏的可能是DNA勺碱基、戊糖或是磷酸二酯键。总之DNA勺正常双螺旋结构遭到破坏，就可能影响其功能。细胞对DNA员伤的修复系统有五种错配修复（识别并修正错误碱基配对的过程）遗传性非息肉结肠直肠癌（HNPCC或Lynch综合征是由于 DNA昔配修复有

39、缺陷而造成 的。DNA复制过程中如果发生错配，如果新合成链被矫正，基因编码信息可得到恢复；但是 如果模板链被矫正，突变就固定；细胞错配修复系统能区分“旧”链与“新”链。Dam甲基化酶可使 DNA的GAT并列中腺喋吟N6甲基化，复制后的 DNA在短期内（数分钟）为半甲基化的 GAT5列，一旦发现错 配碱基，即将未甲基化的链切除，并以未甲基化的链为模板进行修复合成。大肠杆菌参与错配修复的蛋白质至少有12种，其功能或是区分两条链或是进行修复过程。其中含有几个特有的蛋白由 mut基因编码。MutS二聚体识别并结合到 DNA错配碱基部 位，MutL二聚体与MutS结合，二者组成的复合物可沿 DNA双链向

40、两方向移动，DNA由此形 成突环。水解ATP提供的能量驱使ATP移动，知道遇见GATC列为止。随后MutH核酸内切酶结合到 MutSL上毛病在未甲基化链 GATCB点的5端切开。在 切除的过程中解螺旋酶1 1和SSB帮助链的解开。切除的链长达1 0 0。个核甘酸以上，直到将错配的碱基切除。新的DNAB1由DN咪合酶lll和DNA!接酶合成并连接。为了矫正一个错配碱基， 不仅 需要找出错配碱基本身，还需要从远在 1kb以外找出GAT5列，找出未甲基化的“新链”， 加以切除可能长达1000个核甘酸的链，然后再合成新链，这是一个十分耗能的过程由此可看出维持基因信息的完整性对于生物是何等重要。 直接修

41、复紫外线照射可以使 DNA分子中同一条链两相邻胸腺喀咤之间形成二聚体（ TT ）。这种 二聚体是由两个胸腺喀咤碱基以共价键联结成环丁烷的结构而形成的。其他喀咤碱基之间也能形成类似的二聚体，但是数量较少。喀咤二聚体的形成，影响了DNA的双螺旋结构，使其复制和转录功能均受到阻碍。胸腺喀咤二聚体的形成和修复有多种机制，常见的有光修复和暗修复。最早发现细菌在紫外线照射后立即用可见光照射，可以显著提高细菌存活率。光复活的机制是可见光（最有效波长为400nm左右）激活了光复活酶，它能分解由于紫 外线照射而形成的喀咤二聚体。光复活作用是一种高度专一的直接修复方式，它只作用于紫外线引起的 DNA密咤二聚体。光

42、复活酶在生物界分布很广，从低等单细胞生物一直到鸟类都有，而高等的哺乳类却没有。 这种修复在植物中特别重要。高等动物更重要的是暗修复，即切除含喀咤二聚体的核酸链，然后再修复合成。另一钟直接修复的例子是 60 -甲基鸟喋吟的修复。在烷化剂做哟改下碱基可被烷基化， 并改变了碱基配对的性质。甲基化的鸟喋吟在60甲基鸟喋吟一DNA甲基转乙酰基酶作用下，可将甲基转移到酶自身的半胱氨酸残基上，甲基转移酶因此失活， 但却成为其自身基因和另一些修复酶基因转录的活化物 切除修复所谓切除修复，便是在一些系列酶的作用下，将DNA分子中受损伤部分切除掉，并以完 整的那一条链为模板，合成出切去的部分，然后使DN徽复正常结

43、构的过程。这是一种比较 普遍的修复机制，它对多种损伤均能起修复作用。切除修复包括两个过程： 一是由细胞内特异的酶找到DNA的损伤部位，切除含有损伤结构的核甘酸链，二是修复合成并连接。AP位点以及碱基切除修复细胞内有多种特异的 DNA昔酶，他彳门能识别 DNA中不正常的碱基，而将其水解下来。例如在DNAM制过程中聚合酶对脱氧胸腺喀咤核甘三磷酸（dTTP）和脱氧尿喀咤核昔三磷酸（dUTB的分辨能力是不高的，因此常有少量脱氧尿甘酸掺入到DNA链中去。大肠杆菌中的dUTP酶可以分解d UTP成d UMP但是作用有限，不能完全避免dUTP的混入。而且胞喀咤脱氨基后也会转化成尿喀咤。对于上述可能出现的尿喀

44、咤，细胞中的尿喀咤-N-糖甘酶可以把它除去。腺喋吟脱氨后形成次黄喋吟，这一不正常的碱基可被次黄喋吟-N-糖甘酶除去。无喋吟或无喀咤位点常称 AP位点，是核酸内切酶识别作用位点。 AP位点可由多途径产 生，例如一些特异的 DNA-N糖甘酶可以识别异常碱基，水解该糖昔键，产生 AP位点。 通常只有单个碱基缺陷才可以碱基切除修复。AP位点形成后，即有AP核酸内切酶在AP位点附近将DNAK切开。不同AP核酸内切酶 的作用方式不同，或在 5切开，或在3切开。然后核酸外切酶将包括AP位点在内的DNA链切除。DN咪合酶1兼具外切酶活性，并使DNA链沿3端延伸以填补空缺，DNA1接酶将链接上，在AP位点上必须

45、切除若干核甘酸后才能修复合成，细胞内没有酶能够在 AP位置直接将碱基插入，因为 DNA合成的前体物质是核甘酸而不是碱基。 核甘酸切除修复如果DNAg伤造成DNA1旋结构较大变形，则需要以核甘酸切除修复方式才能修复。首先识别损伤位点并由核酸内切酶切开磷酸二酯键。由5 3核酸外切酶将有损伤的DNA片段切除。在 DNAm合酶的催化下，以完整的互补链为模板，按5 3 方向 DNA 链，填补已切除的空隙。 由DNA!接酶将新合成的 DNA片段与原来的DNA断链连接起来，这 样完成的修复能使 DNA恢复到原来的结构。最常见的是短片段的修复，只有多处发生严重损伤才会诱导长片段修复。损伤链由切除酶切除，该酶也

46、是一种核酸内切酶，其可识别多种DN颇伤，包括紫外线 引起的喀咤二聚体和其他光反应产物，碱基的加和物。TTirrnt1mH痛内劝於 支味林 . a卡.I?1,! r ? in in pi皿二徘HIIMI身1M 、叫si序的刷It，y由此可见，切除修复作用是一种普遍的生物功能，它不局限于某种特殊原因造成的损伤,而能一般地识别 DNAZ螺旋结构的改变，对遭到破坏而呈现不正常结构的部分加以去除细胞的这种功能，对于保护遗传物质DNA使它不被轻易得破坏是有很大重要意义的。细胞的切除修复系统和癌症的发生也有一定的关系。有一种称为着色性干皮病的遗传病,这种病患者对日光或紫外线特别敏感， 往往容易出现皮肤癌。 经分析表明，患者皮肤细胞中 缺乏核甘酸切除修复有关的酶， 因此对紫外线引起的 DNA员伤而不能修复，这说明修