RNA提取试验操作步骤注意事项及问题指引

1、RN碾取实验操作步骤、注意事项及问题指南准备试剂：氯仿，异丙醇，75%乙醇，无RNase的水或0.5%SDS（溶液土需用DEPCM理过的水配制）。操作步骤：1 .匀浆处理a.植物组织：以叶片RNA提取为例.取新鲜叶片在液氮中充分研磨或将叶片剪碎后直接在Trizol中研磨,研磨要迅速，最好不要超过1min.,大约100mg叶片使用1mlTrizol.b.动物组织：以鼠肝脏RN破取为例.取新鱼或-70C冻存组织，每50-100mg组织加1mlTrizol,用匀浆仪进行匀处理.样品体积一般不要超过Trizol体积的10%.c.单层培养细胞.直接在培养板中加入Trizol裂解细胞，每10cm2面积加1

2、mlTrizol.用取样器吹打几次.注意：Trizol加量根据培养板面积决定，不是由细胞数决定.如果Trizol加量不足，可能导致提取的RNA中有DNA亏染.d.细胞悬液：离心取细胞，每5-10X106动物、植物和酵母细胞或每107细菌细胞加1mlTrizol。加Trizol前不要洗涤细胞，以免降解mRNA一些酵母和细菌细胞可能需要匀浆仪处理。e.血液处理：直接取新鲜的血液，加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10min,10000rpm离心1min。弃上清，收集白细胞沉淀。每1ml血液收集的白细胞沉淀中加入1mlTrizol。2.将匀浆样品在15-30C放置5mim,使得核酸蛋白复合物完

3、全分离。3 .可选步骤：4C10000rpm离心10min,取上清。如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可离心去除。离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA上清中含有RNA处理脂肪组织样品时，上层是大量油脂，应除去。取澄清的匀浆溶液进行下一步操作。4 .每使用1mlTrizol加0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15s,室温放置3min。如不能涡旋混匀，可手动颠倒混匀2min代替。5 .4C10000rpm离心10-15min,样品会分成三层：红色的有机相，中间层和上层无色的水相，RNAi要在水相中，把水相（约600ul,约为所用Trizol试剂的60%）转移到

4、新管中。（如要分离蛋白质和DNA可保留黄色的有机相）6 .在得到的水相溶液中加入等体积的异丙醇，混匀，-20C放置20-30min。植物或动物组织RN砒取中，容易沉淀出大量的蛋白等污染物，导致电泳检测时看不到RNA可以按以下步骤操作减轻污染：在上清中加入1/2体积的异丙醇，1/2体积的RNA沉剂，然后进行以下操作。7 .4C10000rpm离心10min,去上清。离心前RNAM淀经常是看不见的，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。8 .加入1ml75%乙醇（DEPOK处理过的水配制）洗涤沉淀。每使用1mlTrizol至少加1ml乙醇。9 .410000rpm离心2min,弃上清；短暂快速离心，用移

5、液器小心吸弃上清，注意不要吸弃沉淀。10 .室温放置晾干（不要晾得过干，RNA完全干燥后会很难溶解，大约晾干2-3min左右即可）。加入适量DEPCK（根据实验需要，可加30-100ul水）或0.5%SDS用枪头吸打几次，充分溶解RNA如RN刖于酶切反应，勿使用SD时液。RNA也可用100%的去离子甲酰胺溶解，-70C保存。注意事项：1 .从少量样品中提取RNA（1-10mg组织或102-104细胞）：加800ulTrizol,样品裂解后加氯仿，分层，沉淀RNA前，力口5-10ugRNase-free糖原，糖原会与RN2同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml时不会影响反转录cDNAH一链的合成

6、，也不影响PC或应。2 .匀浆后，加氯仿前，样品可在-70C放置一个月以上：RNAM淀可以保存在75%酉精中，2-8C一个星期或-20C一年以上。 如果要长期保存，RNA可以溶解于100%去离子甲酰胺中，-70C长期保存。预防RNase污染，应注意以下几个方面：1 .经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。2 .使用无RNase的塑料制品和枪头，避免交叉污染。3 .RNA在Trizol试剂中不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150C烘烤4h,塑料器皿可在0.5MNaOH中浸泡10min,然后用水彻底清洗，再灭菌，

7、即可去除RNasa4 .配制溶液应使用无RNase的水（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至中浓度0.1%（v/v）,放置过夜，高压灭菌。注：DEPCW致癌之嫌，需小心操作）。不同组织或细胞RNA提取预期得率植物叶片100-200ug/g叶片动物组织200-400ug/g肝脏组织动植物培养细胞5-10ug/106细胞大肠杆菌2-10ug/mlDH5“过夜菌血液3-5ug/ml人全血问题指南：低得率A.样品裂解或匀浆处理不彻底B.最后得到的RNAM淀未完全溶解A260/A2801.65A.检测吸光度时，RNA羊品不是溶于TE,而是溶于水。低离子浓度和低pH条件下A280会较（WjB.样品匀浆

8、时加的试剂量太少。C.匀浆后样品未在室温放置5min。D.水相中混有有机相。E.最后得到的RNAM淀未完全溶解。RNA条解A.组织取出后没有马上处理或冷冻。B.样品或提取的RNAM淀保存于-5-20C,未在-60-70C保存。C.细胞在胰蛋白酶处理时被破坏。D.溶液或离心管未经RNase去除处理。E.电泳时使用的甲酰胺pH低于3.5。DNA亏染A.样品匀浆时加的试剂体积太少。B.样品中含有组织溶剂（如乙醇，DMS降），强缓冲液或碱性溶液。蛋白和多糖污染A.样品中蛋白、多糖含量高。B.样品量太大。C.水相中混有有机相。D.第6步中加入RNA沉剂可以帮助去除这些污染。RNA取一般步骤总结RN碾取原

9、理：通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。但是由于RNA无处不在，随时可能将RNA降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。RN碾取的一般步骤所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即：样品细胞或组织的有效破碎；有效地使核蛋白复合体变性；对内源RNA酶的有效抑制；有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中最关键的是抑制RNA酶活性。RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径：提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留

10、在水相。第一种提取方法将导致小分子量RNA的丢失，目前该方法的使用频率已很低。实验步骤：破碎组织-分离RNA沉淀RNA洗涤RNARRNA保存RNA1、破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行，可以用盐酸月瓜、硫鼠酸月瓜、NP-40、SDS蛋白酶K等破碎组织，加入3-ME可以才制RNA活性。2、分离RNA一般用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，经过此步，离心，RNA一般分布于上层，与蛋白层分开。3、沉淀RNA-般用乙醇、3MNaAc(pH-5.2)或异丙醇。4、洗涤RNA使用70%乙醇洗涤，有时，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。5、融解

11、RNA-般使用TE。6、保存RNAZ该尽量低温。为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品(如胰脏、肝脏)中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA,对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA在水中保存3年仍保持稳定。另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RN够解在去离子的甲酰胺中，存于-70Co用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA勺杂物。来源于胰脏的RNA少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA寸，可以使用下列方法沉淀RNA加入Na

12、Ac至0.3M,12,000Xg离心5分钟。氯化锂法提取总RNA本方法用高浓度尿素变性蛋白并抑制RNA酶，用氯化锂选择沉淀RNA其特别适合于从大量样品中提取少量组织RNA具有快速简洁的长处，但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高，小RNA丢失的缺陷。试验试剂：1、氯化锂/尿素溶液【氯化锂126g(3M)尿素、360g(6M)加水至1L,过滤灭菌】2、悬浮液【10mM?Tris-HCL(pH7.6),1mM?EDTA(pH8,0),0.5%SDS试验步骤：1、对于大量组织或细胞，则每克组织或细胞加入5-10ml氯化锂-尿素溶液，匀桨器高速匀桨2分钟；对于少量细胞（107个细胞/ml）,则每克组

13、织或细胞加入0.5ml氯化锂一尿素溶液手工匀桨，并转移至Eppendof管中。2、匀桨液在04C放置4小时后，12000g离心30分钟。3、取沉淀，加入原匀桨液1/2体积的氯化锂尿素溶液，重复步骤2。4、沉淀用原匀桨液1/2体积的氯化锂-尿素溶液复溶后，加入等体积酚/氯仿/异戊醇在室温放置15-30分钟并不时摇动混匀，4000g离心5分钟。5、取上层水相，力口1/10倍体积的3M乙酸钠（pH5.2）及2倍体积的乙醇，20c放置1小时，5000g离心。6、70%乙醇洗沉淀一次。真空干燥。7、RNA溶解液溶解沉淀，得RNA分装，于70c保存。蛋白酶-热酚法-本方法适合于病毒RNA勺提取试验试剂：1

14、、蛋白酶K（终浓度50ug/ml）2、2X缓冲液：1%SDS20mMTris-HCL（pH7.6）?0.2MnaCL试验步骤：1、提纯病毒液中加入等体积缓冲液、蛋白酶K,37c40-50分钟。2、加入等体积65c预热的酚溶液，轻徭，在65c保温5分钟后再轻徭。3、离心，取上清，氯仿抽提一次。4、取上层水相，力口1/10倍体积的3M乙酸钠（pH5.2）及2倍体积的乙醇，20c放置1小时，5000g离心（10000g,10min）。5、70%乙醇洗沉淀一次。真空干燥。6、RNA溶解液溶解沉淀，得RNA分装，于70c保存。RNA取实验经验心得总结一：实验的准备实验之前必须先准备好相关的试剂和实验用品

15、.试齐I：1.TRIZOL,一步法提取RNA用的，最好是INVITROGENE勺，100ml850RMB不过也有国产的，便宜些.这个试剂是非常关键的，也是不能省的，经常有很多朋友不想买这个，嫌贵，个人感觉是非买不可，不然用其他办法自己配的话也不便宜，而且配的过程中很毒.2.异丙醇，无水乙醇，三氯甲烷（氯仿），DEPC3.逆转录酶等.一般如果做的次数不是很多的话可以买试剂盒的， 里面什么都有，PROMEGA的也不是很贵，记得是30次的600多.但是如果实验室做得比较多的话，还是自己分开买的比较好.MMLV逆转录酶个人觉得PROMEGA的最好，而且不贵，其他公司我用得也不多，反正一直用PROMEG

16、A,还有DNTP,oligod（T）n,RNA酶抑制剂，除了逆转录酶买PROMEGA的，其他的几样我都是买的TAKARA的，因为promega的其他几样都很贵，这样配起来用一点也不比原装的差.当然实验室比较富裕的也可以买好的，不过话说回来，咱们花的经费大多数还是民脂民膏，这些不太关键的地方省着点比较好（我是不是太罗嗦了！）4.用具.各种大小的枪头和EP管。由于RNA提取过程中对于RNA酶是非常敏感的，所以枪头和管子都要做灭酶处理。灭酶的正常程序是用加入DEPC的水泡枪头和管子，过夜。DEPC勺浓度是0.1%。DEP比强致癌物，做的时候要戴手套口罩，作好防护措施。泡好后再高压，烘干。灭酶除了用D

17、EPC处理外，还可以用氯仿泡枪头和管子，不用泡过夜，1-2小时就行，也没有DEPOT么恐怖，泡后也是高压烘干。5.水。实验用的水也是很关键的，必须用DEPCb理灭过酶的水才可以。具体做法是将去离子水中加入0.1%DEPC摇过夜，之后再高压。高压这步是不能省的，因为必须用高压把残留的DEPO解掉，不然会影响后续的反应。二.实验步骤TRIZOL提取RNA的原理就是利用变性剂将细胞裂解，释放出蛋白质，DNARNA之后根据它们在不同PH值和不同极性溶剂中溶解度不一样。而把RNA提取出来。详细的原理可以自己查一查，在这里不做赘述。1.样品处理对于组织样品，书上说白办法是匀浆后加TRIZOL,但是我的经验

18、是用匀浆器匀浆的话很多组织都是沾在匀浆器的壁上了，所以我一般都是用小剪刀剪，剪的时候要耐心，剪得很碎才行。一般样品其始量大概黄豆那么大一坨就行了，加ImlTRIZOL,然后在EP管中剪碎。样品尽量用新鲜的，不是新鲜的泡在PBS中一段时间也行。样品泡在TRIZOL里面后RNA就基本不会降解，这一步可以放在冰箱里面冻起来，可以保存一段时间2.RNA提取。往第一步中的剪碎的样品和TRIZOL中加入0.2ml的氯仿，之后剧烈摇晃。震荡，此时整个液体的颜色应该变成一种粉红色的。之后静置10分钟，静置后可以看到液体分层了。12000转4度离心10分钟，可以看见液体分层很明显，最上面的是无色的水相，RNAt

19、溶解在里面，中间一层是白色的固体，这层是蛋白质和DNA形成的复合体，下面是红色的酚相。把上层水相吸到另外一个管子里面，注意不要把下面的两层吸出来了，宁愿少一下没关系。往水相液体中加入500ul的无水乙醇或者是异丙醇，上下颠倒混匀，此时如果RNAS多的话可以看见一些油一样的东西，反正就是感觉怪怪的那种，不过一般都不会出现明显的沉淀的。之后12000转离心10分钟，离心之后就可以看见管底有点半透明的东西了，那就是我们要RNA倒掉无水乙醇或者异丙醇，加入500ul用DEPCM理水配制的70%醇，以洗涤RNA加入后把管子敲一敲，尽量使RNA沉淀飘起来。之后在7500转离心8分钟，到掉乙醇，倒扣在干净的吸水纸上面，空气室温干燥，时间可以稍长点，40分钟到1小时，以看不见明显的液滴为准。干后用20ul或者30ulDEPC水溶解RNA50度保温1小时。之后得到的RN