离子交换色谱

1、离子交换层析的基本原理离子交换层析的基本原理离子交换介质的基本性质离子交换介质的基本性质离子交换介质的选择原则离子交换介质的选择原则 离子交换层析是以离子交换剂为固定相，以含特定离子的溶液为流动相，利用离子交换剂上的可交换离子与溶液中离子发生交换作用，由于不同的离子交换能力不一样，待分离的各种离子在树脂柱中随流动相的移动速度也不一样，而将混合物中不同离子进行分离的技术。离子交换剂亦称离子交换介质，通常是一种不溶性高分子化合物如树脂，纤维素，葡聚糖，醇脂糖等；n 含可交换离子n 洗脱的可能性取决于交换反应平衡常数n 吸附的蛋白质可以通过改变pH值，使蛋白 质分子电性发生改变，而洗脱下来。n 不同

2、蛋白质形成离子键数目有差异的，及亲和力不同。n离子交换剂的分类阳离子交换剂：强酸型和弱酸型 可电离的基团 磺酸基（-SO3H） 磷酸基（-PO3H2） 羧酸基（-COOH） 酚羟基（-OH）阴离子交换剂：强碱型和弱碱型 可电离的基团 伯胺基（-NH2） 仲胺基（-NHCH3 ） 叔胺基（-N(CH3)2） 季胺基（-N+(CH3) 3 ）1 1 强酸型阳离子交换树脂强酸型阳离子交换树脂阳离子交换树脂具有酸性基团，如应用最广泛的强酸性磺酸型聚苯乙烯树脂，它是以苯乙烯和二乙烯苯聚合，经浓硫酸磺化而制得的聚合物。 化学性质稳定，510年，耐强酸、强碱、氧化剂和还原剂,不溶于酸、碱及常见的有机溶剂。耐

3、热超过100C。n强离子交换剂的电离率基本不受pH值影响，离子交换作用的pH范围宽n弱离子交换剂的电离率受pH影响很大，离子交换作用的pH范围小弱酸性阳离子交换剂在pH值降低时，其电离率逐渐降低，离子交换能力逐渐减弱弱碱性阴离子交换剂在pH值升高时，其电离率逐渐降低，离子交换能力逐渐减弱常用的离子交换剂n离子交换树脂：离子交换树脂：离子交换纤维素：离子交换纤维素是携带功能基团纤维素衍生物，具有松散的亲水性网状结构以及较大的表面积，大分子可以自由通过，因而对生物大分子（如蛋白质）的交换容量比离子交换树脂大。阳离子型离子交换纤维素包括羟甲基纤维素（CM纤维素）等阴离子型离子交换纤维素包括二乙基氨基

4、乙基纤维素（DEAE纤维素）离子交换纤维素 离子交换纤维素 离子交换纤维素离子交换纤维素 常用的离子交换剂离子交换葡聚糖： 离子交换葡聚糖是葡聚糖经环氧氯丙烷交联后形成的具有多孔三维空间网状结构和离子交换功能基团的多糖衍生物（Sephadex G）Sephadex的优点如下： 亲水性强、不会引起生物分子的变性和失活，母链对蛋亲水性强、不会引起生物分子的变性和失活，母链对蛋白质、核白质、核酸酸及其它生物分子的非特异性吸附能力小及其它生物分子的非特异性吸附能力小 电离基团在母体上取代程度高，交换容量大，装柱方便电离基团在母体上取代程度高，交换容量大，装柱方便，流速快，流速快既有离子交换作用，又有分

5、子筛效应既有离子交换作用，又有分子筛效应 因而Sephadex是一类广泛应用的色谱分离介质在pH7时可耐120的高热 2105的蛋白质 适用于 常用的离子交换剂常用的离子交换剂 常用的离子交换葡聚糖包括： 阳离子交换剂CM-Sephadex C-25，CM-Sephadex C-50Sephadex C-25，Sephadex C-50阴离子交换剂DEAE-Sephadex A-25，DEAE- Sephadex A-50QAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-50 常用的离子交换剂离子交换琼脂糖：离子交换琼脂糖： 离子交换琼脂糖是携带DEAE或CM基团的Sephar

6、ose CL-6B DEAE-Sepharose（阴离子型）和CM-Sepharose（阳离子型）的离子交换介质具有硬度大、性质稳定，流速好，分离能力强等优点。尤其是介质受pH和离子强度的影响所引起的膨胀和收缩效应较小，因此具有稳定的外形体积对pH及温度的变化均较稳定，可在pH310和070范围内使用，改变离子强度或pH时，床体积变化不大。 酸性物质用阴离子交换剂分离碱性物质用阳离子交换剂分离反离子n氨基酸、核苷酸、蛋白质等两性电解质，可根据其pI值及离子化曲线来选择。n活性分子：亲水性基质的交换树脂n具体：种类，离子形式、交换量、颜色、交联度、理化性质等。被分离物质所带的电荷性质 12346

7、789105pH+-蛋白质净电荷等电点吸附阴离子交换剂吸附阳离子交换剂pH pI（-）对pI=5的某酸性蛋白质在pH5.5-9.0的范围内，当蛋白质为阴离子时，应首选DEAE纤维素；在pH3.5-4.5的范围内，当蛋白质为阳离子时，应首选CM纤维素离子交换剂的分类离子交换剂的分类强离子交换剂的电离率基本不受pH值影响，离子交换作用的pH范围宽弱离子交换剂的电离率受弱离子交换剂的电离率受pH影响很大，离子交换作用的影响很大，离子交换作用的pH范范围小围小弱酸性阳离子交换剂在弱酸性阳离子交换剂在pHpH值降低时，其电离率值降低时，其电离率逐渐降低，离子交换能力逐渐减弱逐渐降低，离子交换能力逐渐减弱

8、弱碱性阴离子交换剂在弱碱性阴离子交换剂在pHpH值升高时，其电离率逐渐降低值升高时，其电离率逐渐降低，离子交换能力逐渐减弱，离子交换能力逐渐减弱酸碱处理的次序决定了离子交换剂携带反离子的类型。酸碱处理的次序决定了离子交换剂携带反离子的类型。 交换容量的50，阴离子一般为10-20%。小于5床体积（1分析）。n洗脱：用蒸馏水洗去多余的（没吸附的）样品，然后用洗脱液（缓冲液，pH,离子强度）淋洗，方法有等度，梯度等。补充层析柱平衡平衡缓冲液的用量至少为柱体积的 2 倍平衡缓冲液的流速可略高于正常操作流速平衡终点以流出液的离子浓度、导电性、pH值与缓冲液一致为准，其中pH值最重要 补充补充补充样品洗脱恒定洗脱恒定洗脱阶段洗脱阶段洗脱梯度洗脱梯度洗脱102030405060708090离子强度pH值CC2（C2C1）（）（1V）A2/A1A1 C1 V为流出体积对总体积之比 A2 C2 当当A1A2时为线性梯度，当时为线性梯度，当A1A2时为凹形梯度，时为凹形梯度，A1A2时为凸形梯度。时为凸形梯度。 n若有脂溶性物质则可用非离子型去污剂洗柱后再生，也可用乙醇洗涤，其顺序为：0.5mol/L NaOH-水-乙醇-水-20NaOH-水。n保存离子交换剂时要加