乙肝疫苗的生产工艺

1、 乙肝疫苗是用于预防乙肝的特殊药物。疫乙肝疫苗是用于预防乙肝的特殊药物。疫苗接种后，可刺激免疫系统产生保护性抗苗接种后，可刺激免疫系统产生保护性抗体，这种抗体存在于人的体液之中，乙肝体，这种抗体存在于人的体液之中，乙肝病毒一旦出现，抗体会立即作用，将其清病毒一旦出现，抗体会立即作用，将其清除，阻止感染，并不会伤害肝脏，从而使除，阻止感染，并不会伤害肝脏，从而使人体具有了预防乙肝的免疫力，从而达到人体具有了预防乙肝的免疫力，从而达到预防乙肝感染的目的。接种乙肝疫苗是预预防乙肝感染的目的。接种乙肝疫苗是预防乙肝病毒感染的最有效方法。防乙肝病毒感染的最有效方法。 基因工程乙肝疫苗是乙肝表面抗原（Hb

2、sAg）亚单位疫苗，它系采用现代生物技术将乙肝病毒表达表面抗原的基因进行质粒构建，克隆进入啤酒酵母菌或CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞）中，通过培养这种重组酵母菌或CHO细胞来表达乙肝表面抗原亚单位。发酵后经过细胞破碎和一系列微滤、超滤、硅胶吸附、洗脱等工序，再经过疏水层析，可使产品抗原蛋白纯度达99%以上。 1.目的基因的获取 2.工程菌的构建 3.目的基因的表达 4. 蛋白质的分离纯化 目的基因的获取目的基因的获取 编码乙型肝炎表面抗原的基因的获取编码乙型肝炎表面抗原的基因的获取 一般的目的基因的获取方法有：一般的目的基因的获取方法有：反转录法化学合成法反转录法化学合成法 反转录反转录聚合酶链

3、反应法聚合酶链反应法 工程菌的构建工程菌的构建 CHO(中国仓鼠卵巢）细胞的特点中国仓鼠卵巢）细胞的特点 具有准确的转录后修饰功能具有准确的转录后修饰功能 ,表达的糖基化药表达的糖基化药 物蛋白在分子结构、物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最理化特性和生物学功能方面最 接近于天然蛋白分子接近于天然蛋白分子 具有产物胞外分泌功具有产物胞外分泌功 能能 ,便于下游产物分离纯化便于下游产物分离纯化; 具有重组基因的高效具有重组基因的高效 扩增和表达能力扩增和表达能力; 具有贴壁生长特性具有贴壁生长特性 ,且有较高的且有较高的 耐受剪切力和渗透压能力耐受剪切力和渗透压能力 ,可以进可以进行悬浮

4、培养行悬浮培养 ,表达表达 水平较高水平较高; CHO 细胞属于成纤维细胞细胞属于成纤维细胞 (fibrob2last) ,很少分泌自身的内源蛋很少分泌自身的内源蛋白白 ,利于外源蛋白的后分离利于外源蛋白的后分离 目的基因的表达目的基因的表达 蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化 细胞破碎细胞破碎固液分离固液分离浓缩与初步纯化浓缩与初步纯化高度纯化高度纯化成品加工成品加工 基因工程乙肝疫苗的生产工艺包括发酵、提取、基因工程乙肝疫苗的生产工艺包括发酵、提取、纯化、吸附、配制、分装等工序。纯化、吸附、配制、分装等工序。 生产工艺中采用世界一流的发酵罐，通过全自动生产工艺中采用世界一流的发酵罐，通过全自

5、动控制，提供酵母菌最优生长条件，发酵后经过细控制，提供酵母菌最优生长条件，发酵后经过细胞破碎和一系列微滤、超滤、硅胶吸附、洗脱等胞破碎和一系列微滤、超滤、硅胶吸附、洗脱等工序，再经过疏水层析，可使产品抗原蛋白纯度工序，再经过疏水层析，可使产品抗原蛋白纯度达达99%以上以上 所有工艺设备可自动清洗、自动灭菌，有效地减所有工艺设备可自动清洗、自动灭菌，有效地减少了种种人为因素的干扰，确保生产稳定和质量少了种种人为因素的干扰，确保生产稳定和质量一致性。一致性。 细胞破碎细胞破碎 微滤微滤 超滤超滤 发酵结束后，通过过滤或离心，使酵母与发酵发酵结束后，通过过滤或离心，使酵母与发酵液分离，然后细胞通过高

6、压匀浆机破碎，释放液分离，然后细胞通过高压匀浆机破碎，释放出抗原。酵母的细胞壁较厚，比大肠杆菌难破出抗原。酵母的细胞壁较厚，比大肠杆菌难破碎，可在高压匀浆机内施加几千个大气压力，碎，可在高压匀浆机内施加几千个大气压力，通过针形阀突然降压到零，使细胞破碎。通过针形阀突然降压到零，使细胞破碎。在细在细胞破碎前加入蛋白酶抑制剂以防抗原被分解。胞破碎前加入蛋白酶抑制剂以防抗原被分解。细胞破碎后加入表面活性剂使抗原溶解。粗细胞破碎后加入表面活性剂使抗原溶解。粗细胞裂解物用细胞裂解物用0.2um0.2um中空纤维柱进行微滤。中空纤维柱进行微滤。抗抗原和大部分低分子量宿主细胞内含物通过滤原和大部分低分子量宿

7、主细胞内含物通过滤膜，细胞碎片被膜拦截。膜，细胞碎片被膜拦截。滤液再进行超滤，此时抗原被膜拦截而低分滤液再进行超滤，此时抗原被膜拦截而低分子量宿主细胞内含物通过滤膜除去。子量宿主细胞内含物通过滤膜除去。疏水柱层析疏水柱层析介质： Butyl S Sepharose FF 加入适量硫酸铵，调节电导率与柱层析平衡液电导率相等按照平衡柱床、上样吸附、平衡液洗柱、降低硫酸铵浓度解析、清柱再生程序层析阴离子交换柱层析阴离子交换柱层析介质：DEAE Sepharose FFHBsAg活性蛋白经Sephadex G-25柱脱盐换液，使缓冲盐系统的PH、离子强度和IEC平衡液一致按照平衡柱床、丄样吸附、氯化钠

8、浓度梯度分段洗脱、清柱再生程序层析凝胶过滤柱层析凝胶过滤柱层析介质：Sepharose 4 FF 超滤浓缩到适当体积按照平衡柱床、丄样、洗脱程序层析 无菌过滤无菌过滤氢氧化铝共沉淀氢氧化铝共沉淀 分装分装纯化后的抗原再与氢氧化铝共纯化后的抗原再与氢氧化铝共沉淀，在共沉淀时，抗原吸附沉淀，在共沉淀时，抗原吸附在氢氧化铝上。在氢氧化铝上。疫苗的稳定性较差，一般在疫苗的稳定性较差，一般在28下能保存下能保存12个月，但当温度升高后，效力很快降低。个月，但当温度升高后，效力很快降低。在在37下，许多疫苗只能稳定几天或者几下，许多疫苗只能稳定几天或者几个小时，非常不利于在室温下运输。为了个小时，非常不利

9、于在室温下运输。为了使疫苗的稳定性提高，可用冻干的方法使使疫苗的稳定性提高，可用冻干的方法使之干燥之干燥。收取到的收取到的HBsAg除菌过滤，除菌过滤，即为纯品即为纯品 乙肝疫苗自乙肝疫苗自1979年问世以来，经过年问世以来，经过20多年的大规多年的大规模应用和观察，至今尚未见到有关注射后引起严模应用和观察，至今尚未见到有关注射后引起严重不良反应的报道，只有少数人出现接种部位红重不良反应的报道，只有少数人出现接种部位红肿、硬结、疼痛、手臂酸重或发热、恶心、呕吐、肿、硬结、疼痛、手臂酸重或发热、恶心、呕吐、乏力、皮疹等与一般疫苗接种大致相仿的轻微反乏力、皮疹等与一般疫苗接种大致相仿的轻微反应，多于应，多于1-3天内不治自愈。天内不治自愈。 由于乙肝疫苗属血由于乙肝疫苗属血源性的，在制备过程中纯化与灭活程序十分严密，源性的，在制备过程中纯化与灭活程序十分严密，故不会产生像破伤风等动物血清疫苗可能造成的故不会产生像破伤风等动物血清疫苗可能造成的过敏反应，也