天参益智胶囊中四味药材的薄层色谱鉴别及淫羊藿苷的含量测定

1、天参益智胶囊中四味药材的薄层色谱鉴别及淫羊藿苷的含量测定 作者：朱洁，肖海涛，郝小燕 罗俊，官志忠【关键词】 天参益智胶囊 质量标准 薄层鉴别 淫羊藿苷 高效液相色谱法Abstract：ObjectiveTo establish the quality standard for Tianshenyizhi Capsule. MethodsHerba Epimedii, Radix Angelicae Sinensis, Rhizoma Acori Tatarinowii, Radix Polygoni Multiflori cum Succo Glycines Sotae in Tianshe

2、nyizhi Capsule were identified by TLC, and the content of icariin was determined by HPLC. ResultsThe identification method was highly exclusive. Icariin showed a good linear relationship in the range of 0.3221.61g, and r=0.999 98. The average recovery was 100.7%, RSD= 1.43% (n= 9). ConclusionThe met

3、hod is accurate and simple with good reproducibility, and it can control the quality of this preparation effectively.Key words：Tianshenyizhi Capsule; Quality Standard; TLC; Icariin; HPLC天参益智胶囊是在大量传统经验验方的基础上，研发的一种治疗老年性痴呆疾病的中药制剂。经过初步药效学研究表明1，2，该复方对痴呆大鼠学习记忆能力有明显的改善作用，对胆碱能功能减退有较好的保护和治疗作用，可显着降低老年痴呆大鼠海马和皮

4、质中兴奋性谷氨酸含量，拮抗谷氨酸介导的神经毒性作用，延缓衰老和防治老年痴呆。为研究该产品的质量标准，我们对制剂中的淫羊藿、当归、石菖蒲、何首乌4味药材的薄层鉴别方法进行了研究，并以其中的淫羊藿苷作为指标性成分进行了含量测定。1 仪器与试药1 仪器 HP1100高效液相色谱仪（包括HP1100泵，HP1100紫外检测器，HP1100柱温箱，HP1100/WND-3D工作站），QY-20三用紫外分析仪（上海市闻天仪器设备有限公司），KQ-250B型超声波提取器（昆山市超声仪器有限公司）。2 试剂与药品D-101型大孔吸附树脂（天津农药股份有限公司树脂分公司），硅胶（青岛美晶化工有限公司），氧化铝（

5、200300目，上海新诚精细化工有限公司），淫羊藿苷对照品、当归对照药材、石菖蒲对照药材、何首乌对照药材（由中国药品生物制品检定所提供，批号分别为110737-200312，120927-200615，121098-200403，120934-200507）。乙腈为色谱纯，水为超纯水和蒸馏水，其余试剂均为分析纯。天参益智胶囊（自制0.3 g/粒，批号：200609011，200609012，200609013）。2 方法与结果2.1 薄层鉴别2.1.1 淫羊藿的鉴别取胶囊内容物3 g，加95%乙醇30 ml，超声30 min，滤过，滤液水浴挥干，残渣加1 ml乙醇溶解，作为供试品溶液。取缺淫羊

6、藿阴性样品3 g和淫羊藿药材1 g，同法制备缺淫羊藿阴性样品溶液和淫羊藿药材对照溶液。取淫羊藿苷对照品用甲醇制成1 mgml-1的对照品溶液。分别吸取供试品溶液和缺淫羊藿阴性样品溶液各10 l，淫羊藿药材对照溶液和淫羊藿苷对照品溶液各5 l，分别点于同一硅胶H板上，以氯仿-甲醇-甲酸（1510.2）为展开剂，展开2次，取出晾干。喷以5%三氯化铁乙醇液，晾干。供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰。结果见图1。2.1.2 当归的鉴别取胶囊内容物3 g，置于100 ml的烧杯中，加入水60 ml煎煮1 h，滤过，滤液水浴挥至适量，用石油醚萃取3次，20

7、 ml/次，合并萃取液，水浴挥干，残渣加入醋酸乙酯1 ml使溶解, 作为供试品溶液。另取当归药材1 g，同法制成药材对照溶液。取缺当归阴性样品3 g同样品法制备缺当归阴性样品溶液。参照薄层色谱法3试验，吸取供试液和阴性样品溶液各10 l，当归药材对照溶液5 l，分别点于同一含羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶板GF254上,用正己烷-醋酸乙酯 (101)为展开剂，展开，取出晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视，样品与药材色谱相应的位置处显相同荧光的斑点，阴性样品无干扰。结果见图2。2.1.3 石菖蒲的鉴别取胶囊内容物3 g，置于100 ml的烧杯中，加入水60 ml煎煮1 h，滤过，滤液水浴挥至适

8、量，用石油醚萃取3次，20 ml/次，合并萃取液，水浴挥干，残渣加入醋酸乙酯1 ml使溶解，作为供试品溶液。另取石菖蒲对照药材0.5 g，同法制成药材对照溶液。取缺石菖蒲阴性样品3 g，同样品法制备缺石菖蒲阴性样品溶液。参照薄层色谱法3试验，吸取供试液和阴性样品溶液各10 l，石菖蒲药材对照溶液5 l，分别点于同一含羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G板上，用石油醚-醋酸乙酯 (81)为展开剂，展开，取出晾干， 喷以10% 的磷钼酸乙醇溶液，于105烘烤至斑点清晰。样品与药材色谱相应的位置处显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰。结果见图3。2.1.4 何首乌的鉴别取胶囊内容物3 g，置于100 ml烧杯

9、中，加入蒸馏水50 ml煎煮30 min，滤过，滤液浓缩至适量，用氯仿萃取3次，30 ml/次，合并萃取液，水浴挥干，残渣加入甲醇1 ml使溶解, 作为供试品溶液。另取何首乌对照药材0.5 g，同法制成药材对照溶液。取缺何首乌阴性样品3 g同样品法制备缺何首乌阴性样品溶液。参照薄层色谱法3试验，吸取供试液和阴性样品液各10 l，药材对照溶液3 l， 分别点于同一含羧甲基纤维素钠为粘合剂的高效硅胶G板上，以氯仿-丙酮(7:1)为展开剂，饱和15 min，展开约3.5 cm左右，取出晾干，再以环己烷-醋酸乙酯(10:0.5) 为展开剂, 饱和15 min，展开，取出晾干,置氨蒸气中熏至斑点清晰。样

10、品与药材色谱相应的位置处显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰。结果见图4。2.2 淫羊藿苷的含量测定2.2.1 色谱条件3色谱柱为DiamonsilTM C18（5 m，250 mm 4.6 mm）；流动相为乙腈-水 (3070)；流速1 mlmin-1；进样量10 l；波长270 nm；柱温40。 2.2.2 供试品溶液的制备 取天参益智胶囊内容物0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加稀乙醇25 ml，精密称定，超声1 h，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液即得。2.2.3 对照品溶液的制备精密称取淫羊藿苷对照品20.10 mg，置50 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，为

11、对照品贮备液，浓度为402 gml-1。2.2.4 阴性对照溶液的制备取缺淫羊藿阴性样品粉末约0.5 g，精密称定，按上述供试品溶液的制备方法，制备阴性对照溶液。2.2.5 系统适用性实验分别吸取供试品溶液、对照品溶液和阴性对照溶液，按前述色谱条件测定。结果表明，在本实验条件下，淫羊藿苷与其他组分峰分离度大于1.5，阴性对照无干扰，理论塔板数按淫羊藿苷峰计算不低于1 500。结果见图5。2.2.6 线性关系考察分别精密吸取对照品储备液2，4，6，8，10 ml置于25 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，备用；按上述色谱条件测定各浓度溶液的峰面积，以进样量（g）为横坐标（X），以峰面积为纵坐

12、标（Y），绘制标准曲线，淫羊藿苷在0.3221.61 g线性关系良好。回归方程为Y=16.904 8X-7.120 7，r= 0.999 98。2.2.7 精密度实验精密吸取同一对照品溶液10 l，按前述色谱条件重复进样6次，测得淫羊藿苷峰面积积分值的RSD为0.14%，表明测定仪器精密度良好。2.2.8 重复性实验取同一批样品，按“供试品溶液的制备”方法，平行制备供试品溶液6份，按前述色谱条件测定，测定淫羊藿苷含量，峰面积RSD为0.87%，表明测定方法重复性良好。2.2.9 稳定性实验取同一批样品制成的供试品溶液10 l，分别在0，2，4，8，12，24 h各进样1次，测得淫羊藿苷在24

13、h内峰面积的RSD为0.39%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。2.2.10 回收率实验取已知含量的样品约0.25 g，共9份，精密称定，分别加入不同量的淫羊藿苷对照品，按“2.2.2”方法制备，测得淫羊藿苷的平均回收率为100.7%，RSD为1.43%（n = 9），表明测定方法准确可靠。结果见表1。 表1 回收率实验结果（略）2.2.11 样品含量测定取3批样品，按“2.2.2”方法制备样品溶液，分别精密吸取所得供试品溶液10 l，注入液相色谱仪测定。结果见表2。表2 样品测定结果 （略）3 讨论淫羊藿的薄层鉴别中中国药典（2005年版部）采用以醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水（10111）

14、为展开剂，三氯化铝作为显色剂，实验中显色效果欠佳，改用以氯仿-甲醇-甲酸（1510.2）为展开剂，以三氯化铁显色，分离效果好，斑点显色清晰。中国药典（2005年版部）中采用挥发油对石菖蒲进行定性鉴别，而该制剂的制备工艺中石菖蒲为直接水煎煮，因此我们对石菖蒲的定性鉴别方法进行改进，其结果所建立的方法显色效果明显，成点性好。在当归定性鉴别中，按中国药典（2005年版部）用乙醚超声处理，斑点多、干扰大，改用石油醚超声后，以正己烷-醋酸乙酯（101）为展开剂，效果较好。何首乌的定性鉴别中，按中国药典（2005年版部）中以苯-乙醇（21）为展开剂，斑点不明显，且苯毒性大，故将展开剂改为氯仿-丙酮（71），饱和15 min, 展开约3.5 cm左右，取出晾干，再以环己烷-醋酸乙酯（100.5）为展开剂，饱和15 min，二次展开，取出晾干，置氨蒸气中熏至斑点清晰，效果较好。淫羊藿为本品的君药，所含的黄酮具有较好的脑神经保护作用4，淫羊藿苷为淫羊藿中主要成分，故将淫羊藿苷作为指标性成分进行了含量测定，所建立的测定方法具有准确、简便、快速、重复性好等特点，有利于