抗链霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及其免疫学特性鉴定

1、文章编号:100028551(2007052506204抗链霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及其免疫学特性鉴定范国英1王建华1钟华2杨艳艳3邓润广3张改平3(11西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨陵712100;21河南科技学院动物科学学院,河南新乡453003;31河南省农业科学院生物所,河南郑州450002摘要:用E DC 一步法和戊二醛法将S M 偶联于载体蛋白牛血清白蛋白(BS A 和OVA ,合成免疫原BS A 2S M 和包被原OVA 2S M 。用紫外线扫描、S DS 2PAGE 进行鉴定;用BS A 2S M 免疫BA LB C 小鼠,用杂交瘤技术建立分泌S M mAb 的细

2、胞株3F92C4;对S M mAb 的效价、亲和性、敏感性和特异性等免疫学特性进行鉴定。结果表明,BS A 2S M 人工抗原分子结合比为125;筛选出3F92C4敏感特异的杂交瘤细胞1株,间接E LIS A 测定细胞培养上清,效价为1312×102,同种型为IgG 2a ;腹水的亲和常数(K a 为814×1011L m ol ;IC 50为8199g L ,与双氢链霉素交叉反应为10916%,与其他S M 结构相似物和功能近似物无交叉反应性。本试验获得了抗S M 高价、敏感、特异的mAb ,可用于S M 的残留检测。关键词:链霉素;单克隆抗体;免疫学特性GENERATI

3、ON AN D IMMUN OLOGICA L TRAIT OF MON OC LONA L ANTIBODY FOR STREPTOMYCINFAN G uo 2ying 1W ANGJian 2hua 1ZH ONG Hua 2Y ANG Y an 2yan 3DE NG Run 2guang 3ZH ANG G ai 2ping3(11The Animal Science and technology College ,Northwest Sci 2Tech University o f Agriculture and Forestry ,Yangling ,Shaanxi 712100

4、;21The Animal Science College ,H enan Institute o f Science and Technology ,Xinxiang ,H enan 453003;31Institute o f Biology and Technique Science ,Agricultural Academy o f H enan Province ,Zhengzhou ,H enan 450002Abstract :The coating antigen OVA 2S M and immunogen BS A 2S M synthesized with S M was

5、 coupled with BS A and OVA by E DC 2method and glutaraldehyde method.Ultraviolet and S DS 2PAGE were used to identify S M artificial antigen.BA LB C mice were immunized by BS A 2S M ,the hybridoma lines that secrete S M mAb were established by using m onoclonal antibody hybridoma technology.The immu

6、nological traits such as titer ,affinity ,sensitivity and specificity of this mAb were characterized.The results showed that the conjugation ratio of S M to BS A in S M artificial antigen was about 251.The titer ofsupernatant hybridoma cell lines of 3F92C4was 1312×102by indirect E LIS A.The is

7、otypes in ascites was IgG 2a ,the affinity constant (K a was 814×1011L m ol ,IC50was 8199g L ,cross 2reactivity to dihydrostreptomycin was 10916%andlittle cross 2reactivity to other com pounds.The experiment generated S M mAb was high 2titer ,sensitivity and specificity.And this mAb can be used

8、 to detecte S M residues in food.K ey w ords :streptomycin ;m onoclonal antibody ;immunological traits收稿日期:2006211215基金项目:“十五”国家重大科技专项(001BA804A30作者简介:范国英(19732,女,河南焦作人,在读博士,主要从事动物中毒性及营养代谢性疾病研究。E 2mail :fanguoy 通讯作者:王建华(19482,男,河南南阳人,教授,主要从事动物中毒性及营养代谢性疾病研究。E 2mail :jhwang1948链霉素(S M 属于氨基糖苷类抗生素,用于革兰氏

9、阴性菌和结核杆菌感染治疗,在治疗家畜感染性疾病中发挥了重要作用,但其毒副作用较大1。1999年农业部在动物性食品中兽药最高残留限量中规定,牛奶中链霉素的最高残留限量(MR L 为200g kg 2。然而,相应的链霉素检测技术并不完备,由于氨基糖苷抗605核农学报2007,21(5:506509Journal o f Nuclear Agricultural Sciences生素缺少发色基团,应用HP LC分析时常要对其衍生化,设备条件过高,难以普及;并且其理化测定方法相当复杂、通用性差3。免疫学分析方法具有灵敏、快速、特异性强、简便等优点,已在兽药、农药残留检测领域广泛应用4。本研究旨在为链霉

10、素残留免疫学检测方法的建立和拥有自主知识产权检测产品技术的开发奠定基础。1材料与方法111试验材料SPF级6周BA LBC小鼠,购自郑州大学医学院实验动物中心,在本实验室饲养。小鼠骨髓瘤细胞株NS0由英国国家动物健康研究院惠赠。S M、牛血清白蛋白(BS A、卵清蛋白(OVA、12乙基232(32二甲基氨基丙基碳化二亚胺盐酸盐(E DC、O2羧甲基羟胺、戊二醛(G A、弗氏完全佐剂(FC A、弗氏不完全佐剂(FI A等化学试剂均为Sigma产品,纯度9910%;羊抗鼠酶标二抗(G aMIgG2HRP由本实验室制备;3,3,5,52四甲基联苯胺(T M B购自上海华美;其他试剂市售所得,均为AR

11、级;试验用水为超纯水。准确配制1gL的S M母液(1g S M溶于1L双蒸水中,根据需要配制标准液;洗液(P BST为含体积比0105%T ween220的P BS液;包被液(C BS为011m olL pH916的碳酸盐缓冲液;阻断E LIS A的封闭液、稀释液为含体积比5%猪血清的P BST;酶底物为T M B的磷酸2柠檬酸缓冲液;终止液为2m olL硫酸。112人工抗原的合成与鉴定11211人工抗原的合成采用E DC一步法合成人工抗原。第1步,与O2羧甲基羟胺在pH9的条件下反应,引入羧基;第2步,用E DC一步法将S M偶联到载体蛋白BS A和OVA上。反应液用葡聚糖凝胶Sephade

12、x G225柱纯化,用T LC监测,收集R f=0112组分,制得人工抗原BS A2S M,冻干,4保存备用。同样方法制得包被抗原OVA2E DC2S M。为消除桥抗对单克隆细胞筛选的影响,同时用戊二醛(G A方法制备包被原S M2G A2OVA。11212人工抗原的鉴定(1UV鉴定:用P BS配制S M和BS A标准溶液,取一定量的BS A2S M溶于P BS,用Braford法5测定其蛋白质的浓度,据此浓度调节BS A2 S M溶液中蛋白质的浓度,使之与BS A标准溶液一致,在波长200400nm范围内进行紫外线扫描,参照杨利国等6方法计算BS A与S M的分子结合比。(2S DS2 PA

13、GE鉴定:参照K amm ps等7的方法。113细胞融合用小鼠的筛选用BS A2S M免疫6周龄BA LBC小鼠5只,剂量20g200l只,背部皮下分点注射。首免,用无菌P BS 溶解BS A2S M,与等量FC A混合,充分乳化;加强免疫,用无菌P BS溶解BS A2S M,与等量FI A混合,充分乳化,首免后4周进行,共免5次,每次间隔26周,最后1次免疫后10d断尾采血分离血清,用间接E LIS A检测抗S M抗体效价,若效价<116×10-3即可用于细胞融合;超免,最后1次加强免疫后430周,细胞融合前35d,尾静脉与腹腔各注射BS A2S M50g200l只。选择对链

14、霉素效价高,且抑制效果较好的小鼠用于融合。114杂交瘤细胞株的建立11411细胞融合融合过程参照杨利国6等的方法。超免量为80g只,采用静脉注射和腹腔注射同时进行。11412杂交瘤细胞株的筛选融合细胞共培养14d,在第10天用HT培养液换液,第14天开始检测,用RPMI21640完全培养液补充培养;用间接E LIS A和阻断E LIS A进行阳性孔筛选,选择强阳性、抑制率高、细胞生长旺盛的孔转到24孔板上扩大培养,冻存一部分细胞后,再进行有限稀释克隆化,而后再检测、扩大培养、冻存、鉴定和建株2。115SM mAb的制备及其免疫学特性鉴定11511S M mAb的制备体内诱生腹水法。11512S

15、 M mAb免疫学特性鉴定采用秋水仙素阻断法14进行核型分析;采用间接E LIS A检测制备的S M mAb效价;按鉴定试剂盒说明进行操作;参照Batty18所述方法测定其亲和常数(ka;阻断E LIS A测定S M mAb对S M的半数抑制(IC50,以IC50值衡量其敏感性;用氨基糖苷类及其他抗生素类药物作为抑制剂测S M mAb的半数抑制浓度,计算其交叉反应率(CR%。2结果与分析211人工抗原鉴定UV鉴定BS A的特征峰在278nm,S M没有紫外特征峰,两者偶联后,其峰与载体蛋白相比没有太大变化,故不能用紫外来计算其偶联率。S DS2PAGE鉴定结果见图1。图1表明,BS A的泳动速

16、度大于BS A2S M,说明BS A2S M的分子量大于BS A,证明偶联成功;用紫外凝胶成像系统分析软件分析得出,BS A2S M的分子量为710×105D L,BS A的分子量为6162×105D L,BS A与S M 的分子结合比约为125。212杂交瘤细胞株的建立7055期抗链霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及其免疫学特性鉴定 图1BS A2S M偶联的S DS2PAGE鉴定Fig.1Identification of BS A2S Mconjugation by S DS2PAGE1:marker;2:BS A;3:BS A2S M细胞融合后10d观察融合效果,4

17、 块细胞培养板384孔中全部有杂交瘤细胞克隆形成,融合率为100%;间接E LIS A检测,阳性13孔,阳性率317%;阻断E LIS A筛选,3次克隆化后获得1株杂交瘤细胞,定名为3F92C4,并分别测定其IC50。多次传代,8次冻存及复苏,杂交瘤细胞分泌抗体稳定。213SM mAb免疫学特性鉴定结果21311杂交瘤核型鉴定结果NS0染色体数目为62 68条,小鼠脾细胞染色体数目为40条,本试验获得的杂交瘤染色体数目为96102条,平均98条。21312同种型鉴定IgG仅有单体形式,其重链含有三个恒定区结构域。小鼠有四个亚类,分别为IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3。用Pierce公

18、司的小鼠mAb同种型间接E LIS A检测试剂盒鉴定,本试验所制的单克隆抗体F13923F92C4的同种型为IgG2a。21512效价测定结果杂交瘤3F92C4分泌的抗S M mAb细胞培养上清效价达到了1312×102。阻断E LIS A测定腹水效价为1112×106,Batty法12测定其亲和常数为814×1011Lm ol。21513敏感性鉴定结果曲线的回归方程为y=-371397x+851692,根据回归方程计算出3F92C4对S M的IC50为8199gL,S M的阻断E LIS A检测限可确定为1gL,本试验所获mAb对S M具有较高的敏感性。2151

19、5特异性鉴定结果S M的IC50为8199gL,说明S M对其mAb结合反应的特异性很强;与双氢链霉素的交叉反应为10916%,与其他抗生素类的交叉反应率均小于01001%(表1。结果表明,S M mAb对S M及其类似物有较好的特异性。图2阻断E LIS A检测S M IC50Fig.2IC50inhibitive curve of S M mAbby com petitive E LIS A表1S M与S M类似化合物的交叉反应T able1The percent of cross2reactivity of S Mwith S M analog ous com pounds类似物anal

20、oguesIC50(gL交叉反应率cross2reactivity(%双氢链霉素dihydrostreptomycin81210916链霉素streptomycin8199100卡那霉素kanamycin>1000<01001庆大霉素gentamycin>1000<01001盐霉素salinomycin>1000<01001氨苄青霉素am picillin>1000<01001妥布霉素tobramycin>1000<01001丁胺卡那霉素amikacin>1000<01001萘替米星netimicin>1000<

21、;01001紫苏霉素sis omycin>1000<01001泰勒菌素taylorella>1000<01001磺胺嘧啶sulfadiazine>1000<01001磺胺二甲氧嘧啶sulfadimethoxine>1000<01001磺胺间甲氧嘧啶sulfam onomethoxine>1000<010013讨论完全抗原的制备是建立小分子免疫学分析方法的基础,S M是小分子化合物,分子量M N=581126,结构简单,不具备免疫原性,根据Landsteiner9创立的小分子半抗原免疫学理论,半抗原设计遵循不产生新的抗原决定簇、间隔臂性

22、质稳定且长度适宜、化学反应简单易行三个原则,选择S M上的醛基作为偶联位点,用羧甲基羟胺引入羧基,再与载体蛋白上的氨基偶联,偶联率较高,免疫原性较好。Sion f等10认为,一定长度的间隔臂的介入,有助于半抗原结构的暴露和特异性抗体的产生,但是间隔臂过长可形成新的抗原表位,易被细胞识别而产生“桥抗体”,间隔臂过短则载体蛋白的空间位阻将影响细胞805核农学报21卷对半抗原的识别,不产生特异性抗体,最好的间隔臂是36个直链碳,长度以58!为宜。本试验以N CH 3COO 作间隔臂,长度适宜,产生了针对S M 的特异性抗体。关于半抗原与载体蛋白的最佳分子结合比目前尚未形成定论,Eilange 11提

23、出最佳分子结合比为5251,Schneider 等12提出以10201为好,吴松如等13认为以3451为好。本试验S M 与BS A 的分子结合比为25:1,并取得了较好的免疫效果。间隔臂抗体的产生是不可避免的。故在制作多抗时,会产生不能抑制或抑制限较高,即使在选用不同的包被原时,亦不能产生很好的结果。故在筛选单抗时,合理筛选程序决定了能否成功地获得1株高亲和力的单抗。本试验采用三种方法同时检测,第一步,用与免疫原合成完全相同的方法合成的包被原进行筛选,即可获得目的半抗原抗体和间隔臂抗体;第二步,用与免疫原不同的合成方法,即对间隔臂不同的包被原进行筛选,获得的阳性孔即为目的半抗原的抗体;第三步

24、,同时用两种方法合成的包被原包被作抑制试验,抑制限较低的阳性孔即可进行扩大培养,冻存及亚克隆。本试验成功合成了S M 人工抗原,经4次免疫BA LB C 小鼠后获得了高效价的pAb ,通过杂交瘤技术获得1株高亲和力和高特异性的杂交瘤细胞,经多次传代、冻存与复苏,杂交瘤分泌抗体稳定,经鉴定制备出的S M mAb 高价、敏感、特异,可以用于S M 残留检测的免疫学试验。参考文献:1于船,王万钦.中国兽药知识大全.四川:四川科学技术出版社,1997,7367372李俊锁,邱月明,王超.兽药残留分析.上海:上海科学技术出版社,2002,3443503van Bruijnsv oort M ,Ottin

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26、ment of a polyclonal antiserum and assay procedures using novel streptomycin derivatives Analyst ,2005,130(6:9649705T ijssen P.Practice and theory of enzyme immunoassay.Amsterdam :E lsever ,19856杨利国,胡少旭,等.酶联免疫测定技术.南京:南京大学出版社,19987K am ps H C ,Carlin R J ,et al.Analysis of hapten 2carrier proteinconj

27、ugates by nondenaturing gel electrophoresis.Journal Immunological M ethods ,1993(164:2452538Batty J D ,Beatty B G,W lanos W G.M easurement of m onoclonalantibody affinity by non 2com petitive enzyme immunoassay.Journal of Immunology M ethods ,1987(100:1731799Landsteiner K.The specificity of SERO LOG ICA L reactions.HarvardUniversity Press ,Boston ,194510S ion f I ,Bruce D ,et al.C om parision of coating and immunizing antigenstructure on the sensit