地塞米松、维甲酸对大鼠肺发育的影响及与胰岛素样生长因子关系

1、315论著地塞米松、维甲酸对大鼠肺发育的影响及与胰岛素样生长因子关系华中科技大学同济医学院附属同济医院儿科(湖北武汉430030)刘汉楚3常立文容志惠祝华平张谦慎陈红兵【摘要】目的探索地塞米松(Dex)、维甲酸(RA)对大鼠肺发育的影响及其与胰岛素样生长因子(IGF)-、(IGF)-的关系。方法将80只SD孕鼠分为4组,即对照组(A组)、Dex1组(B组)、Dex2组(C组)、RA组(D组)。A、B、D组于孕1820d分别皮下注射生理盐水、Dex,腹腔注射RA,C组于生后13d皮下注射Dex。各组于孕18、20、21d(C组孕期不取)、生后1、3、5、7、10、14、21d取肺标本作病理学检查

2、、辐射状肺泡计数(RAC)、IGF-、IGF-多肽或mRNA之肺表达强度。结果形态学及肺表达:B、C组早期肺泡发育提前(数目多,壁薄),晚期则腔大数少;IGF-主要表达于肺胞分隔期(生后410d),A、D组等肺泡发育时,IGF-呈强阳性表达,其他各组或时间点则呈弱阳性或阴性表达;IGF-的表达主要见于出生前支气管,小血管等管道组织,受Dex等影响较小。Westernblot结果:IGF-多肽的表达:A组生后57d达高峰,随后渐降低;B组孕20d生后3d,各时间点强度明显高于A组(P0.01),以后均低于A组(P0.01);C组晚期强度明显低于A组(P0.01);D组各时间点浓度明显高于A组(P

3、0.01)。IGF-多肽的表达:各组孕18d最高,随后渐降低直至微量。RT-PCR结果:IGF-、IGF-mRNA表达的强度变化与各自的肽浓度变化相似。结论IGF-、IGF-与肺发育过程有密切关系,IGF-主要作用于肺发育的早期,而IGF-主要作用于肺泡分隔和成熟期,浓度越高,肺发育越完善。【关键词】地塞米松【中图分类号】R729维甲酸肺发育胰岛素样生长因子【文章编号】1000-3606(2005)05-315-04【文献标识码】ARelationshipofdexamethasone,retinoicacidandinsulin-likegrowthfactorsduringlungde2v

4、elopmentinneonatalratsLiuHanchu,ChangLiwei,RongZhihui,ZhuHuaping,ZhangQian2430030sheng,ChenHongbing,DepartmentofPediatrics,TongjiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan,Hubei【Abstract】ObjectiveToexploretherelationshipofinsulin-likegrowthfactor(IGF)-,IGF-and80preg

5、nantSprague-Dawley(SD)ratswererandomlydividedlungdevelopmentinneonatalrats.Methodsinto4groups(n=20).ControlgroupwasdefinedasgroupA,inwhich20pregnantratswereinjectedsub-cutaneouslywithnormalsalineduring18to20daysingestation.Dexamethasone(Dex)treatmentgroup1wasdefinedasgroupB,inwhich20pregnantratswere

6、injectedsubcutaneouslywithDex(0.5mg/kgd)atthesametimeasgroupA.Dextreatmentgroup2wasdefinedasgroupC,inwhichallneonatalratswereinjectedsubcutaneouslywithDex(25g/d)in1to3daysafterbirth.Retinoicacid(RA)treatmentgroupwasdefinedasgroupD,inwhich20pregnantratswereinjectedintraperitoneallywithalltrans-RA(500

7、g/kgd)atthesametimeasgroupA.Lungtissueswerecollectedatfollowingtimes:18,20,21daysingestationand1,3,5,7,10,14,21daysrespectivelyafterbirthforhistopathologyexamination,IGF-,IGF-peptidesandmRNAexpressiondeterminations(immunohistochemistry,WesternblotingandRT-PCR).Results(1)IGF-,IGF-peptides:Thehigheste

8、xpressionlevelofIGF-ingroupAandDoccurredon57daysafterbirth(alveolardevelopmentperiod).TherewasapositivecorrelationbetweenIGF-andalveolardevelopment.ThehighestexpressionlevelofIGF-ingroupBwasonthethirddayafterbirth.IncomparisonwithgroupA,theexpressionlevelsofIGF-ingroupBweremuchhigherfrom18daysingest

9、ationto3daysafterbirth(P0.01)butsignificantlylowerintheothertimes(P0.01).TheexpressionlevelsofIGF-ingroupCwerelowerbutingroupDwerehigherthanthoseinGroupAatanytime(P0.05).(2)RT-PCR:ThetrendsofIGF-andIGF-mRNA3现在武汉市儿童医院通讯作者:刘汉楚E-mail: 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd

10、. All rights reserved.316expressionweresimilartothatofIGF-andIGF-peptides.ConclusionsIGF-andIGF-closelycorrelatedwithlungdevelopmentinneonatalrated.IGF-actsintheperiodofseptumformationandalveolusmaturationwhereasIGF-atearlierperiod.TherewasapositivecorrelationbetweentheIGF-expressionandthelungdevel2

11、opment.【Keywords】dexamethasoneretinoicacidlungdevelopmentinsulin-likegrowthfactor医学技术的发展使围生期极低出生体重儿、超低出生体重儿的成活率大大提高,但肺发育不成熟和肺发育不良所致的呼吸衰竭仍是围生期高患病率和高死亡率的重要因素。寻找有效方法早期评估肺发育程度并阐述肺发育机理,是当今研究的热点。近年来国外学者研究显示,胰岛素样生长因子(insulin-likegrowthfactor,IGF)系统与肺发育及成熟有关1,但多种研究结果尚不一致,而国内尚无类似报道。本研究通过寻找大鼠肺发育过程中的IGFs变化规律,并

12、以一定的药物进行干预,以期探膜,该直线上的肺胞数就是RAC值,可反映终末呼吸单位含肺泡数的多少,衡量肺泡化程度,光镜下观察,每张切片计数5次,取其平均值。免疫组织化学(SP法):按常规操作,一抗浓度:IGF-125(NEOMARKERS,USA);IGF-150(博士德生物工程公司产品,武汉)。在高倍镜下观察IGF-、IGF-表达的时空分布,表达强度以着色深浅判断:未着色为阴性,浅棕黄色为弱阳性,棕黄色为中度阳性,棕褐色为强阳性。4.肺组织westernblot分析:冰浴条件下以三讨IGF系统与新生儿肺发育的关系。材料和方法一、实验动物健康雌性SpragueDawley污剂进行组织匀浆;4,1

13、2000g离心10min,弃除沉淀,采用考马斯亮蓝对上清进行蛋白定量,取40g蛋白,加入上样缓冲液,煮沸5min后进行SDS-PAGE,转膜,封闭,分别用1400的抗IGF-、IGF-多克隆抗体和-actin抗体进行杂(SD)体重200250g,大鼠80只(本校实验动物中心提供)雌雄按31合笼交配,次日晨取阴道分泌物涂片,镜检见精子,当日记为妊娠第1天(足月为222d)。所有孕鼠给予自由饮食和饮水。二、方法:1.分组:将孕鼠随机分为4组,每组20只。对交,二抗分别采用1800和11000稀释,利用化学发光法进行显色反应,最后对结果进行光密度扫描,以特异性IGF-、IGF-条带吸光度“A”值与同

14、标本-actin条带A值之比进行半定量分析。5.肺组织IGF-、IGF-mRNA表达(RT-PCR照组(A组):孕1820d皮下注射生理盐水;地塞米松(Dex)1组(B组):孕1820d皮下注射Dex0.5mg/(kgd);Dex2组(C组):生后13d新生鼠皮下注射Dex25g/d;维甲酸(retinoicacid,RA)组(D组):孕1820d腹腔注射RA500g/(kgd)。2.肺组织标本留取:所有4组(C组孕期不取)法):RNA提取及cDNA第一链合成分别按TRI-ZOL,MMLV逆转录酶说明书进行。引物序列及扩增条件参照Out等4设计,IGF-、IGF-和-actin引物序列及预计产

15、物大小分别为:IGF-:上游5-AAGCCTACAAAGTCAGCTCG-3,下游5-GGTCTTGTTTCCTGCACTTC-3,产物114bp;IGF-:上游5-ATCCCAGTGGGGAAGTCG-3,下游5-GTAGACACGTCCCTCTCG-3,产物281bp;-actin:上游5-ATCTGGCACCACACCTTCTACAATGGCTGCG-3,下游5-CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3,扩增产物838bp。分别于孕18、20、21、生后1、3、5、7、10、14、21d将动物过量麻醉(苯巴比妥钠50mg/kg)处死取胎鼠或新生鼠肺标本1,部分

16、标本经4%多聚甲醛适当固定,石蜡包埋后切片供组织学检查,部分标本迅速液氮罐中冷冻后置-70冰箱保存,以作Westernblot或RT-PCR之用。3.肺组织形态学、辐射状肺泡计数(radialalveolarcounts,RAC)及IGF-、IGF-之肺表三、统计学分析资料用s表示,采用SAS8.0软件系统的方差分析及q检验。结果达:取肺石蜡块5m切片,HE染色,光镜下观察肺组织发育情况及病理改变。参照Jakkula的方法3,从呼吸性细支气管中心到垂直线至最近纤维隔或胸一、肺组织形态学检查RAC值及IGF-、IGF-之肺表达 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optica

17、l Disc Co., Ltd. All rights reserved.3171.IGF-的多肽表达:对照组从孕18d起逐1.肺组织形态学、RAC值:A组3d时肺组织基本结构为终末囊泡,腔大壁厚数少;5d后肺泡数目显著增多;21d时变为腔小壁薄数多之成熟肺泡,间质细胞少或消失。B组、C组早期(生后3d)肺泡发育提前,晚期则发育受阻;D组则各时间点肺泡结构及数目均优于A组、B组、C组。各组RAC值见表1。2.IGF-、IGF-的表达:IGF-主要表达于渐升高,生后57d达高峰,随后渐降低直至微量;B组高峰期提前至生后3d,且孕20d生后3d各时间点浓度明显高于A组(P0.01),以后各时间点则

18、明显低于A组(P0.01);C组(除3d、5d)各时间点浓度均明显低于A组(P0.01);D组各时间点浓度明显高于A组(P0.01),见表2。2.IGF-的多肽表达:各组孕18d强度最高,随后渐降低直至微量;B组生后13d强度明显高于A组(P0.05);C组、D组各时间点浓度与A组差异无显著性(P0.05),见表3。三、IGF-、IGF-mRNA表达IGF-、肺泡分隔期(生后410d),定位于胞浆,A组、D组等肺泡发育成熟时,IGF-呈强阳性表达,其他各组或时间点则呈弱阳性或阴性表达;IGF-的表达亦在胞浆,主要见于出生前支气管。小血管等管道组织,应用Dex可短期促进其表达,随后与A组无差异。

19、二、Westernblot结果表1各组不同时期RAC值比较(s,个)组别A组B组C组D组F值Pn3d4.600.115.620.234.900.145.000.1837.180.011)1)1)5d6.450.156.780.176.620.196.911)1)7d20.216.950.187.420.176.010.012)10d9.020.198.300.148.0350.800.011)1)14d10.050.168.670.168.470.1210.280.29139.050.011)1)21d10.530.318.

20、830.128.780.1210.380.28160.910.011)1)2)20202020注:与A组比较:1)P0.05,2)P0.01表2各组IGF-I多肽表达强度比较(AIGF-I/A-actin)分组n孕18d孕20d1d0.670.030.740.010.670.021)1)3d0.780.010.860.010.810.010.790.0247.520.012)2)5d0.940.020.810.010.950.021.080.03102.300.012)2)7d0.990.010.770.020.840.010.970.02207.780.012)2)10d0.840.010.

21、620.010.760.020.890.02495.200.012)2)2)21d0.470.010.350.010.370.020.520.02134.590.05-14.350.01D组200.360.010.620.020.700.028.160.01注:与A组比较:1)P0.05,2)P0.01表3各组IGF-多肽表达强度比较(AIGF-/A-actin)分组A组B组C组D组F值Pn孕18d孕20d1d1)3d0.730.020.830.020.760.010.770.0127.440.057d0.710.030.670.020.690.020.690.012.680.0510d0.5

22、50.020.550.010.580.020.580.023.150.0521d0.320.010.320.020.350.030.330.021.240.05202020201.000.030.900.020.850.010.980.010.940.020.900.02-0.290.05-3.730.050.840.016.990.050.990.020.910.010.860.02注:与A组比较1)P0.05;2)P0.01 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.318IGF-mRNA表

23、达的强度变化与各自的肽浓度变化规律相似,见图12。图1对照组各时间点IGF-mRNA的表达注:M:Marker;18分别为孕18d、孕20d、生后1d、3d、5d、7d、10d、21d免地导致肺泡分隔受阻。有人推测糖皮质激素使微血管成熟太早,不利肺泡形成;或在肺泡分隔时抑制细胞增殖和复制;阻止肺泡变薄;破坏型细胞向型细胞转化以阻碍肺发育。本研究发现,产前及产后应用Dex后,短期内可使IGF-,IGF-多肽及mRNA的表达增加,故肺泡发育提前;但随后IGF-表达降低,从而影响肺泡分隔及成熟。因此推测Dex对肺发育的抑制与IGF系统有关,即通过干扰IGFs的表达起作用。三、RA对IGFs的影响RA

24、可促进IGF-多肽及mRNA的表达,促进肺泡分隔和成熟。8Massaro等研究表明,单用RA能使肺泡数增加,肺泡变小,与Dex合用则能预防Dex对肺泡分隔及成熟的抑制。本研究中应用RA之大鼠肺发育明显优于其他组,其IGF-多肽及mRNA的表达明显强于它组,从而提示RA调节肺发育与IGFs有关。综上所述,本研究从肺发育过程中的形态学变化结合IGF-、IGF-之多肽及mRNA的时空表达表明:IGF-、IGF-与肺发育过程密切相关,其浓度越高,越有利于肺发育,且各自作用时期不同。IGF-主要作用于肺发育的早期,而IGF-主要作用于肺泡分隔和成熟期。参考文献1.WallenLD,MyintW,Shim

25、asakiK,etal.Cellulardis2tributionofinsulin-likegrowthfactorbindingproteinmRNAsandpeptidesduringratlungdevelop2ment.Endocrinology,1997,155:313-327.2.ChangLW,RongZH,ZhangQS.Effectofretinoicacidonlunginjuryinhyperoxia-exposednewbornrats.JHuazhongUnivSciTechnologMedSci,2003,23(1):71-74.3.JakkulaM,LeCras

26、TD,GebbS,etal.Inhibitionofangiogenesisdecreasesalveolarizationinthedevel2opingratlung.AmJPhysiolLungcellMolPhysiol,2002,279(3):L600-607.4.OueT,TairaY,MiyazakiE,etal.Effectofantenatalglucocorticoidadministrationoninsulin-likegrowthfac-torandlevelsinhypoplasticlungnitrogen-induc-edcongenitaldiaphragma

27、ticherniainrats.PediatrSu-rgInt,1999,15(3-4):175-179.5.袁安波,石晓峰,上官明,等.新生儿急性肾功能衰竭时图2各组生后3d、5dIGF-mRNA的表达注:M:Marker;14,58分别A组、B组、C组、D组生后3d、5d讨论为便于研究,通常将肺的发育分为五期:假腺期、小管期、囊泡期、肺泡期及成熟期,这些分期对不同种系间的研究具有重要意义。一、IGFs在肺发育中的作用IGFs是许多组织生长和分化的重要调节因子1,5,其在肺发育中所起作用正逐渐为人们所重视。Wallen等1通过IGF-、IGF-基因的无义突变而致严重肺发育阻滞;Mauceri

28、等6通过测定肺中IGFs的水平发现,IGF-水平降低则肺发育不良;IGF-水平降低则肺泡分隔受阻。本研究通过测定IGF-、IGF-多肽及mRNA的表达变化,进一步证实了其与肺发育的关系。在假腺期、小管期、囊泡期,以IGF-的表达为主,主要参与肺泡上皮增殖、分化及支气管、血管等形成,而后则IGF-明显升高,在肺泡形成及再分的关键时期(肺泡期)浓度达高峰,且表达越强,肺泡发育越成熟。此期肺泡分隔频繁,成纤维细胞凋亡,使肺泡壁变薄。一旦肺泡成熟,其浓度迅速下降,故IGF-与肺泡分隔及成熟有关。二、糖皮质激素对IGFs的影响Dex等糖皮质激素由于可促进未成熟儿肺表面活性物质合成,常用来预防肺透明膜病和

29、治疗早产儿肺发育不良7。但最近研究表明,产前及产后应用可的松类不能改善早产儿预后,反而增加死亡率。且均不可避血、尿胰岛素样生长因子-的变化及意义.临床儿科杂志,2003,21(5):306-308.6.MauceriHJ,BeckerKB,ConwayS.Theinfluenceofethanolexposureoninsulin-likegrowthfactor(IGF) 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.319LungCellMolPhysiol,2002,282:L477-483.

30、8.MassaroGD,MassaroD.Postnataltreatmentwithretinoicacidincreasesthenumberofpulmonaryalveoliinrats.AmJPhysiol,1996,270(2Pt1):L305-310.(收稿日期:2004-11-03)typereceptorsinfetalrattissues.LifeSci,1996,59(1):51-60.7.LuyetC,BurriPH,SchittnyJC.Suppressionofcellpro-liferationandprogrammedcelldeathbydexametha-s

31、oneduringpostnatallungdevelopment.AmJPhysiol3714例小儿呼吸道感染时抗生素应用调查山东省威海市立医院(山东威海【中图分类号】R725【文献标识码】A264200)梁秀娟张培英李宁华【文章编号】1000-3606(2005)05-319-02小儿呼吸道感染是使用抗生素最多的疾病,合理应用抗生素对及时控制感染、缩短病程和改善预后起重要作用。抗生素的不合理使用不仅造成耐药菌的形成,还可使患儿发生反复呼吸道感染及不易治愈,这已引起临床医师的重视,通过提高医务人员的业务水平果然可减少抗生素的滥用1,但在抗生素不合理使用的原因中,由患儿家属自作主张或医院、个体诊所推荐使用抗生素因素不可忽视。现就患儿来院就诊前选用抗生素的情况调查分析如下。临床资料观察对象为2002年14月间在我院儿科门诊就医的患儿,符合以下条件:发病后均初次到本院就治,来院前已应用了抗生素。入选患儿3714例,其中男2250例,女1464例;年龄2个月12岁;发病至就诊时间47d。所有患儿就诊时均详细询问此次发病后使用的抗生素的