重组狗凝血因子Ⅷ的慢病毒介导体外表达的研究

1、重组狗凝血因子的慢病毒介导体外表达的研究         08-03-03 13:15:00     编辑：studa20      作者：孙海英，程海，李振宇，杜冰，曾令宇，鹿群先，何徐彭，潘秀英，徐开林【摘要】  本研究的目的是制备携带狗凝血因子（cF）基因的慢病毒载体，探讨慢病毒载体能否介导cF在体外的有效表达。用构建携带cF基因的慢病毒载体pTK161（含PUB启动子）和pTK162（含2OH1启动子），同时

2、构建含绿色荧光蛋白（GFP）的慢病毒载体pTK161（含PUB启动子）和pTK162（含2OH1启动子）的方法，分别与包装质粒NRF、包膜蛋白质粒VSVG共转染293T包装细胞，将包装好的病毒颗粒再感染293T细胞，检测病毒滴度和培养细胞上清中cF活性。结果显示：经限制性酶切鉴定，成功构建了pTK161、pTK162、pTK161和pTK162正向连接载体；pTK161和pTK162的病毒滴度分别为1.54×106 U/ml和2.83×106 U/ml；pTK161、pTK162感染靶细胞后24小时细胞上清中即可检测到cF的表达，72小时表达量达高峰。pTK162载体cF表

3、达活性接近正常狗血浆F活性，而且明显高于pTK161(p<0.05)，6周后cF表达活性仍达最高值的1/4。结论：构建的自身失活慢病毒载体可携带较大片段的cF基因，并在体外可获得有效表达；本研究为慢病毒载体介导的血友病A的基因治疗研究提供实验依据。 【关键词】  慢病毒     Expression of Recombinated Canine Factor In Vitro Mediated by  Lentiviral Vector      Abstract &#

4、160;  The study was purposed to prepare the recombinant lentiviral vector pTK161 and pTK162 carrying Bdomaindeleted canine factor (BDDcF) gene, and to investigate whether the canine F(c) can be expressed in vitro. The BDDcF gene was ligated behind PUB and 2OH1 promotors to create lentiviral vec

5、tors  pTK161 and pTK162. Meantime lentiviral vectors pTK161 and pTK162 were  produced  by cloning a green fluorescent protein (GFP) into pTK151 and pTK152, which was driven by PUB and 2OH1 promotors respectively. Vector supernatant were prepared by using transfer calcium phosphate med

6、iatedcotransfection of 293T cells. The virus vector, NRF packagingplasmid, and VSVG envelopeplasmid was assayed by titers and cF activity in cell culture supernatant after infection into  293T cells. pTK161, pTK162, pTK161 and pTK162were identified by restriction enzyme analyzing. The results s

7、howed that the lentiviral vectors pTK161,pTK162, pTK161 and pTK162 were successfully constructed, and  the titers of pTK161and pTK162 reached to 1.54×106 U/ml and 2.83×106 U/ml; the activity of cF could be detected at 24 hours after  infection of 293T cells  by pTK161 

8、and pTK162, and achieved the highest level at 72 hours later. The higher level of cF activity was achieved by transfected with pTK162 than that of  pTK161 (p<0.05), which  closed to the cF activity in normal dog plasma. 1/4 of the highest level could be detected 6 weeks later.  It

9、is concluded that  the prepared HIV1based lentiviral vectors can  infect 293T cells to express cF effectively. The results provide the basis for further studying  HIV1based lentiviral vector gene therapy for hemophilia A.    Key words     lentiviral

10、vector；canine factor ；hemophilia A；gene therapy       血友病A是凝血因子（F）基因缺陷导致凝血因子缺乏的X隐性连锁的出血性疾病。目前该病的治疗方法主要是输注血浆源性F制品或基因重组F产品，这种蛋白替代疗法疗效肯定，但存在费用昂贵、血源性病毒感染、反复输注会产生抑制性抗体等许多棘手的问题1-3。由于血友病A是一种单基因遗传病，基因治疗可望成为一种有效治疗手段4。 本研究分别构建了含有 PUB 启动子和2OH1启动子cF的慢病毒表达载体pTK161和pTK162，采用三质粒包装系统，检

11、测感染细胞上清中的cF活性，为血友病A慢病毒载体介导基因治疗寻求有价值的实验依据。     主要试剂    各种工具酶、1 kb DNA Ladder、质粒小量提取试剂盒WizardTM Plus SV Minipreps DNA Purification Systerm、目的基因纯化试剂盒WizardTM PCR DNA Purification System、线性化载体纯化试剂盒WizardTM DNA CleanUp System均购自Promega 公司，凝血因子F活性检测试剂盒CoamaticR 

12、0; Factor 购自Chromogenix公司。    质粒、菌种、包装细胞    慢病毒载体pTK151（含有PUB启动子）、慢病毒载体pTK152（含有2OH1启动子）由本室构建，pBKCMV（含B区缺失型FcDNA，BDDFcDNA）由北卡大学基因治疗中心晁恒军博士惠赠，包装质粒NRF、包膜质粒VSVG、感受态大肠杆菌、包装细胞293T等均由本室制备或保存。    载体的构建及鉴定    用Xba I和EcoR V双酶切pBKCMV，得到4 400 bp的BDDFc

13、DNA片段,用低熔点凝胶进行电泳，WizardTM PCR DNA Purification System 纯化后作为插入片段。用Xba I和Hpa I双酶切pTK151，与纯化后的BDDFcDNA片段进行连接反应，连接后的载体用BamH酶切鉴定，将正确的载体命名为pTK161。用Afe I单酶切pTK152，CIAP去5P，WizardTM DNA CleanUp System纯化后，将插入片段BDDFcDNA插入到pTK152的Afe I酶切位点上，连接后载体用BamH鉴定，将正确的载体命名为pTK162（图 1）。    Figure 1. 

14、60; Construction  map  of  Lentiviral  vector  including  BDDFcDNA.  重组慢病毒的包装    采用磷酸钙共沉淀法5将重组质粒pTK161、pTK162（各15 g）分别与包装质粒NRF（10     g）、包膜蛋白质粒VSVG（5 g）共转染293T细胞，用含10%胎牛血清的DMEM培养过夜，12小时后更换 无血清培养液，于37、5% CO2条件下 继续培养。60小时后收集病毒上清，过滤后

15、-80保存。此外，在pTK151的PUB后插入绿色荧光蛋白（GFP）基因（pTK161）和在pTK152的2OH1后插入GFP后（pTK162），观察GFP表达情况。    病毒滴度的测定    将293T细胞按照2×105/孔接种于6孔板上，吸附6小时后，将所收集的含pTK161和pTK162病毒上清分别按对数级稀释，将1 ml稀释后的病毒上清分别加入到相应的孔中，过夜培养后，更换培养液，48小时后，于荧光显微镜下计数荧光阳性细胞个数，用下面的公式计算病毒滴度，并用流式细胞仪（FACS）检测GFP阳性细胞百分率。 

16、;   病毒滴度（U/ml）=GFP阳性细胞数×    相应的稀释倍数6    狗的凝血因子F活性测定    用pTK161和pTK162感染293T细胞后在不同时间点收集细胞上清，按照CoamaticR  Factor 试剂盒操作说明，用发色底物法检测细胞上清中cF的活性，以感染前的细胞上清作为空白对照，并以正常狗的混合血浆作为参比血浆，绘制标准曲线（选择0-1.5 U/ml范围），将测得的分光光度值在标准曲线上读数。    结    果