第十章维生素的测定2

1、.1第十章第十章 维生素的测定维生素的测定.2一、概述一、概述维生素是维持人体正常生命活动所必需的一类天维生素是维持人体正常生命活动所必需的一类天然有机化合物。其种类很多，目前已确认的有然有机化合物。其种类很多，目前已确认的有30余种，其中被认为对维持人体健康和促进发育至余种，其中被认为对维持人体健康和促进发育至关重要的有关重要的有20余种。必须经常从食物中摄取维生余种。必须经常从食物中摄取维生素；长期缺乏任何一种维生素都会导致相应的疾素；长期缺乏任何一种维生素都会导致相应的疾病。病。 .3 维生素化学结构各异，生理功能也各不相同，化学结构上没有共性。大多数维生素不稳定，对光照、氧气、PH值和

2、加热都非常敏感。 胺类（VB1） 醛类（Vb6） 醇类（Va）等维生素维生素水溶性维生素水溶性维生素脂溶性维生素脂溶性维生素维生素维生素B、C等等维生素维生素A、D、E、K.4富含维生素的食品 Va：胡萝卜、西红柿、红薯等； B1：胚芽、米糠、麸皮等； B2：动物肝脏、鸡蛋、牛奶等； B12：只有肉类食品有这种维生素； Vc: 各种新鲜蔬菜，新鲜水果等； VE: 麦胚油、玉米油、芝麻油、豆类等。.5为什么检测维生素为什么检测维生素 我们在评价食品的营养价值，开发利用高我们在评价食品的营养价值，开发利用高含量维生素的食品资源，指导人们合理调含量维生素的食品资源，指导人们合理调整膳食结构，指导制定

3、加工工艺或贮存条整膳食结构，指导制定加工工艺或贮存条件，最大限量地保留各种维生素，还要控件，最大限量地保留各种维生素，还要控制强化食品中加入量，防中毒，都离不开制强化食品中加入量，防中毒，都离不开分析检测工作。分析检测工作。 维生素主要检测方法： 1、化学分析法（比色法、滴定法） 2、色谱分析法.6脂溶性脂溶性V的测定的测定 VA、VD、VE、与类脂物一起存于食物中，摄与类脂物一起存于食物中，摄食时可吸收，可在食时可吸收，可在体内积贮体内积贮。 脂溶性维生素具有以下理化性质：脂溶性维生素具有以下理化性质： 1溶解性：脂溶性维生素不溶于水，易溶于溶解性：脂溶性维生素不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙

4、酮、氯仿、乙醚、苯等有机溶剂脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、苯等有机溶剂。 2耐酸碱性：维生素耐酸碱性：维生素A、D对酸不稳定，对酸不稳定， 对对碱稳定，维生素碱稳定，维生素E对碱不稳定，但在抗氧化剂存对碱不稳定，但在抗氧化剂存在下或惰性气体保护下，也能经受碱的煮沸。在下或惰性气体保护下，也能经受碱的煮沸。.7 3耐热性、耐氧化性：耐热性、耐氧化性： 耐热性耐热性 氧化性氧化性VA 好，能经受煮沸好，能经受煮沸 易被氧化易被氧化 （光、热（光、热 促进其氧化）促进其氧化）V D 好，能经受煮沸好，能经受煮沸 不易被氧化不易被氧化 V E 好，能经受煮沸好，能经受煮沸 在空气中能慢慢被化在空气中能

5、慢慢被化 （光、热、碱促进其（光、热、碱促进其 氧化）氧化）.8 根据上述性质测定脂溶性维生素时，通常：根据上述性质测定脂溶性维生素时，通常：皂化样品皂化样品 水洗去除类脂物水洗去除类脂物 有机溶剂有机溶剂提取脂溶性维生素提取脂溶性维生素(不皂化物不皂化物) 浓缩浓缩 溶于适当的溶剂溶于适当的溶剂 测定。测定。 在皂化和浓缩时，为防止维生素的氧化分解，常加入在皂化和浓缩时，为防止维生素的氧化分解，常加入抗氧化剂抗氧化剂(如焦性没食子酸、维生素如焦性没食子酸、维生素C等等)。 对于对于A、D、E共存的样品，或杂质含量高的样品，在共存的样品，或杂质含量高的样品，在皂化提取后，还需进行层析分离。皂化

6、提取后，还需进行层析分离。.91 1、维生素、维生素A A的测定的测定-三氯化锑比色法三氯化锑比色法（GB/T 5009.82-2003）维生素维生素A A的测定常用的方法有三氯化锑比色法、的测定常用的方法有三氯化锑比色法、紫外分光光度法、荧光分析法、液相色谱法。紫外分光光度法、荧光分析法、液相色谱法。（1）原理原理氯仿溶液中维生素A+三氯化锑蓝色可溶性配合物620nm波长比色.10（2）适用范围及特点适用范围及特点本法适用于维生素A含量较高的各种样品（含量高于510g/g）。该法的主要缺点是生成的蓝色配合物的稳定性差，比色测定必须在6S6S内完成，否则蓝色会迅速消退，将造成极大误差。.11（

7、3）试剂无水硫酸钠、乙酸酐无水乙醚（不含过氧化物）无水乙醇（不含醛类物质）三氯甲烷（不含分解物和水）250g/L三氯化锑三氯甲烷溶液1+1氢氧化钠溶液、0.5mol/L氢氧化钾.12（4）测定步骤样品预处理样品测定样品预处理含有维生素A的样品大多需首先除去脂肪，把维生素A从脂肪中分离出来。常规的去脂方法是采用皂化法和研磨法。.13A、皂化法、皂化法:适用于维生素适用于维生素A含量不高的样品，含量不高的样品，但全部试验过程费时，且易导致维生素但全部试验过程费时，且易导致维生素A的损的损失。失。皂化皂化:称取称取0.55g经组织捣碎机捣碎或充分混匀经组织捣碎机捣碎或充分混匀的样品于三角瓶中，加入的

8、样品于三角瓶中，加入l0ml 1：1氢氧化钾及氢氧化钾及2040ml乙醇，在电热板上回流乙醇，在电热板上回流30min。加入。加入10m1水，稍稍振摇水，稍稍振摇,若无浑浊现象，表示皂化完若无浑浊现象，表示皂化完全。全。.14提取提取 将皂化液移入分液漏斗，先用将皂化液移入分液漏斗，先用30ml水分水分两次冲洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗。再用两次冲洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗。再用 50ml乙醚分两次冲洗皂化瓶，所有洗液并入分乙醚分两次冲洗皂化瓶，所有洗液并入分液漏斗，振摇液漏斗，振摇2min，提取不皂化部分。，提取不皂化部分。.15 静止分层后，水层放入第二分液漏斗。皂静止分层后，水层放入第二分

9、液漏斗。皂化瓶再用化瓶再用 30ml30ml乙醚分两次冲洗，洗液倾入乙醚分两次冲洗，洗液倾入第二分液漏斗，振摇后静止分层，将水层第二分液漏斗，振摇后静止分层，将水层放入三角瓶，醚层并入第一分液漏斗。如放入三角瓶，醚层并入第一分液漏斗。如此重复操作，直至醚层不再使三氯化锑一此重复操作，直至醚层不再使三氯化锑一三氯甲烷溶液呈蓝色为止。三氯甲烷溶液呈蓝色为止。.16洗涤洗涤 在第一分液漏斗中加在第一分液漏斗中加30ml30ml水，轻轻振水，轻轻振摇，静止片刻后，放出水层。再加入摇，静止片刻后，放出水层。再加入151520ml 0.5mol/L20ml 0.5mol/L的氢氧化钾溶液，轻轻振摇后，的氢

10、氧化钾溶液，轻轻振摇后，弃去下层碱液（弃去下层碱液（除去醚溶性酸皂除去醚溶性酸皂），继续用），继续用水洗涤，至水洗液不再使酚酞变红为止。醚水洗涤，至水洗液不再使酚酞变红为止。醚液静置液静置1010 20min20min后，小心放掉析出的水。后，小心放掉析出的水。.17浓缩浓缩 将醚层液经过无水硫酸钠滤入三角瓶中，将醚层液经过无水硫酸钠滤入三角瓶中，再用约再用约25ml25ml乙醚冲洗分液漏斗和硫酸钠两次，乙醚冲洗分液漏斗和硫酸钠两次，洗液并入三角瓶内。用水浴蒸馏，回收乙醚。洗液并入三角瓶内。用水浴蒸馏，回收乙醚。待瓶中剩约待瓶中剩约5ml5ml乙醚时取下。减压抽干，立即乙醚时取下。减压抽干，立

11、即准确加入一定量三氯甲烷（约准确加入一定量三氯甲烷（约5ml5ml左右），使左右），使溶液中维生素溶液中维生素A A含量在适宜浓度范围内含量在适宜浓度范围内(3(35g5g）。）。.18B B、研磨法、研磨法 适用于每克样品维生素适用于每克样品维生素A A的含量大的含量大于于5 510g10g样品的测定，如猪肝的分析。步骤样品的测定，如猪肝的分析。步骤简单、省时，结果准确。简单、省时，结果准确。研磨研磨 精确称取精确称取2 25g5g样品，放入盛有样品，放入盛有3 35 5 倍倍样品质量的无水硫酸钠研钵中，研磨至样品中样品质量的无水硫酸钠研钵中，研磨至样品中水分完全被吸收，并均质化。水分完全被

12、吸收，并均质化。.19提取提取 小心地将全部均质化的样品移入带盖的小心地将全部均质化的样品移入带盖的三角瓶内，准确加入三角瓶内，准确加入5050100ml100ml乙醚。紧压盖子，乙醚。紧压盖子，用力振摇用力振摇2min2min；静置澄清（大约需；静置澄清（大约需1 12 h2 h），），或离心澄清（保持低温）。或离心澄清（保持低温）。浓缩浓缩 取澄清提取乙醚液取澄清提取乙醚液2 25m15m1，放入比色管，放入比色管中，在中，在70708080水浴上抽气蒸干；然后立即加水浴上抽气蒸干；然后立即加入入lmllml三氯甲烷溶解残渣。三氯甲烷溶解残渣。.20标准曲线的绘制6个比色管编号 1 2 3

13、 4 5 6加各种浓度VA标液1mL 10 20 30 40 50 60 ug/ml乙酸酐d 1 1 1 1 1 1.21 于于620nm620nm波长处，以波长处，以 10ml10ml三氯甲烷加三氯甲烷加 1 1滴乙酸酐滴乙酸酐调节吸光度至零点；然后将标准比色系列按顺序调节吸光度至零点；然后将标准比色系列按顺序移入光路前，迅速加入移入光路前，迅速加入9ml9ml三氯化锑一三氯甲烷溶三氯化锑一三氯甲烷溶液，于液，于6s6s内测定吸光度（每支比色管都在临测前内测定吸光度（每支比色管都在临测前加入显色剂）。以维生素加入显色剂）。以维生素A A含量为横坐标，以吸光含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制曲

14、线。度为纵坐标绘制曲线。.22(5) (5) 样品测定样品测定 1mL 1mL样品溶液，加样品溶液，加1 1滴乙酸酐。其余步骤滴乙酸酐。其余步骤同标准曲线的制备。测定样品溶液的吸光度，同标准曲线的制备。测定样品溶液的吸光度，从标准曲线中查出相应的维生素从标准曲线中查出相应的维生素A A含量。含量。.23（6）计算式中 -维生素A含量； c-由标准曲线上查得样品溶液中维生素A的含量，mg/L； m-样品质量，g； V-样品提取后加入三氯甲烷定容之体积，mL； 100-以每100g样品计。1001000cxVm .24（7）说明及讨论维生素A极易被光破坏，实验操作应在微弱光线下进行，或使用棕色玻璃

15、仪器。乙醚为溶剂的萃取体系，易发生乳化现象。在提取、洗涤操作中，不要用力过猛，若发生乳化，可加几滴乙醇破乳。.25 所用氯仿中不应含有水分,因三氯化锑遇水会出现沉淀，干扰比色测定。故在每毫升氯仿中应加入乙酸酐1滴，以保证脱水。另外，由于三氯化锑遇水生成白色沉淀，因此用过的仪器要用稀盐酸浸泡后再清洗。 .26由于三氯化锑与维生素A所产生的蓝色物质很不稳定，通常生成6S后便开始比色，产生蓝色后立即读取吸光度。如果样品中含-胡萝卜素（如奶粉、禽蛋等食品）干扰测定，可将浓缩蒸干的样品用正己烷溶解，以氧化铝为吸附剂，丙酮、乙烷混合液为洗脱剂进行柱层析。 .27二、 高效液相色谱法测定食物中VA、Ve （

16、 GB/T5009.822003 ） 高效液相色谱法测定维生素是近几年发展起来的方法，此法能快速分离和测定维生素和它的同分异构体、酯及其衍生物。内容见课本.281.原理原理样品中的维生素样品中的维生素A及维生素及维生素E经皂化提取处理后，经皂化提取处理后，将其从不可皂化部分提取至有机溶剂中。用高效液相将其从不可皂化部分提取至有机溶剂中。用高效液相色谱法色谱法C18反相柱将维生素反相柱将维生素A和维生素和维生素E分离，经紫外分离，经紫外检测器检测，并用内标法定量测定。检测器检测，并用内标法定量测定。 最小检出量分别为最小检出量分别为VA：0.8ng；E：91.8ng；E：36.6ng；E：20.

17、6ng。.292 试剂试剂 无水乙醚、无水乙醇、三氯甲烷等试剂需预先处无水乙醚、无水乙醇、三氯甲烷等试剂需预先处理。理。 维生素维生素A标准溶液、维生素标准溶液、维生素E标准溶液标准溶液 内标物溶液：内标物溶液：10g10g苯并苯并e芘芘 /mL3 仪器和设备仪器和设备高压液相色谱仪带紫外分光检测器。高压液相色谱仪带紫外分光检测器。 .304.操作步骤操作步骤4.1样品处理样品处理4.1.1皂化皂化称取称取110g样品样品(含维生素含维生素A约约3g，维生素，维生素E各异构体约为各异构体约为40g)于皂化瓶中，加于皂化瓶中，加30mL无水乙无水乙醇，进行搅拌，直到颗粒物分散均匀为止。加醇，进行

18、搅拌，直到颗粒物分散均匀为止。加5mL 10%抗坏血酸抗坏血酸，苯并苯并e芘标准芘标准液液2.00mL，混匀。，混匀。加加10mL1:1氢氧化钾氢氧化钾，混匀。于沸水浴上回流，混匀。于沸水浴上回流30min使使皂化皂化完全。皂化后立即放入冰水中冷却。完全。皂化后立即放入冰水中冷却。.314.1.2提取提取 将皂化后的样品移入分液漏斗中，用将皂化后的样品移入分液漏斗中，用50mL水分水分23次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用约次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用约100mL乙醚乙醚分两次分两次洗洗皂化瓶及其残渣，乙醚液并入分液漏斗皂化瓶及其残渣，乙醚液并入分液漏斗中。如有残渣，可将此液通过有少许脱

19、脂棉的漏斗滤中。如有残渣，可将此液通过有少许脱脂棉的漏斗滤入分液漏斗。轻轻振摇分液漏斗入分液漏斗。轻轻振摇分液漏斗2min，静置分层，静置分层，弃弃去水层去水层。4.1.3洗涤洗涤 用约用约50mL水洗水洗分液漏斗中的乙醚层，用分液漏斗中的乙醚层，用pH试纸试纸检验直至水层不显碱性检验直至水层不显碱性(最初水洗轻摇，逐次振摇强度最初水洗轻摇，逐次振摇强度可增加可增加)。.32水层水层皂化瓶内混合物皂化瓶内混合物分液漏斗分液漏斗1 1号号水洗水洗乙醚洗乙醚洗振摇，静置，分层振摇，静置，分层水层水层醚层醚层分液漏斗分液漏斗2 2号号振摇，静置，分层振摇，静置，分层醚层醚层水层水层分液漏斗分液漏斗3

20、 3号号振摇，静置，分层振摇，静置，分层醚层醚层分液漏斗分液漏斗1 1号号提取提取.33振摇，静置，分层振摇，静置，分层分液漏斗分液漏斗1 1号号水洗水洗醚层醚层水层水层KOHKOH溶液洗溶液洗振摇，静置，分层振摇，静置，分层醚层醚层KOHKOH溶液层溶液层水洗水洗振摇，静置，分层振摇，静置，分层醚层醚层水层水层振摇，静置，分层振摇，静置，分层水洗水洗醚层醚层水层水层净化净化.34分液漏斗醚层分液漏斗醚层乙醚洗涤乙醚洗涤水浴蒸馏水浴蒸馏减压抽干减压抽干乙醇定容（乙醇定容（5mL)5mL)离心上机离心上机无水硫酸钠无水硫酸钠浓缩浓缩.354.2高效液相色谱分析条件（推荐条件）预柱：ultrasp

21、here ODS 5m，4mm4.5cm。分析柱：ultrasphere ODS 5m，4.6mm25cm。流动相：甲醇 水98 2。混匀。于临用前脱气。紫外检测器波长：300nm。量程0.02。进样量：20L。流速：1.0mL/min。.364.3标准曲线的制备4.3.1维生素A和维生素E标准浓度的标定方法取维生素A和各维生素E标准液若干微升，分别稀释至3.00mL乙醇中，并分别按给定波长测定各维生素的吸光值。用比吸光系数计算出该维生素的浓度。 311000. 31001SEAX标准加入标准的量S,ul比吸光系数，Ecm1%波长，,nm视黄醇（VA）10.001835325-生育酚100.0

22、71294-生育酚100.092.8298-生育酚100.091.2298.374.3.2标准曲线的制备（采用内标法） 把一定量的维生素A、生育酚、生育酚、生育酚及内标苯并e芘液混合均匀。 进样，色谱分析。 以维生素峰面积与内标物峰面积之比为纵坐标，维生素浓度为横坐标绘制维生素标准曲线，或计算直线回归方程。 本方法不能将E和E分开，E峰中包含有E峰。 .384.4样品分析取样品浓缩液20L，待绘制出色谱图及色谱参数后，再进行定性和定量。4.4.1定性：用标准物色谱峰的保留时间定性。4.4.2定量：根据色谱图求出某种维生素峰面积与内标物峰面积的比值，以此值在标准曲线上查到其含量。或用回归方程求出

23、其含量。5计算式中：X2某种维生素的含量，mg/100g；C由标准曲线上查到某种维生素含量，g/mL；V样品浓缩定容体积，mL；m样品质量， g。10001002VmCX.39 胡萝卜素是一种广泛存在于有色蔬菜和水果中的天然色素，有多种异构体和衍生物，总称为类胡萝卜素，在人体内可转变为维生素A，故称为维生素A原。如、胡萝卜素，其中-胡萝卜素效价最高。.40胡萝卜素的性质： 胡萝卜素对热及酸、碱比较稳定，紫外线和空气中的氧可促进其氧化破坏。胡萝卜素易溶于有机试剂，可用有机溶剂从食物中提取。胡萝卜素含有共轭双键数目较多，本身是一种色素，在450nm波长处有最大吸收。测定方法：薄层色谱、纸色谱、HP

24、LC国家标准中采用纸色谱法进行测定GB/T 1238919901. 测定原理 试样经皂化后，以丙酮和石油醚提取食物中的胡萝卜素及其他植物色素；以石油醚为展开剂进行纸层析，胡萝卜素极性最小，将胡萝卜素与与其他色素分离；剪下含胡萝卜素的区带，洗脱后于450nm波长下定量测定。.412 操作方法（1）样品处理粮食：样品用水洗三次，置60烤箱中烤干，磨粉，储于塑料瓶内保存，备用。蔬菜与其他植物性食物：取可食部用水冲洗三次后，用纱布吸去水滴，切碎，用匀浆器制成匀浆，贮于塑料瓶内，冰箱内保存备用。（2）提取（需避光条件下进行）取适量样品（相当于含胡萝卜素约2080g）置于100mL带塞锥形瓶中.42植物油

25、和高脂肪样品：需先皂化，取适量样品(10g)，加脱醛乙醇30mL，再加10mL 1:1氢氧化钾溶液，回流加热30min，然后用冰水使之迅速冷却，皂化后样品用石油醚提取，直至提取液无色为止。 （3）洗涤提取液静置分层，弃去下层水溶液；反复用5%硫酸钠溶液振摇洗涤，直至下层水溶液清亮为止。将皂化后样品提取液用水洗涤至中性。石油醚提取液通过盛有10g无水硫酸钠的小漏斗，漏入球形瓶，用少量石油醚分数次洗净分液漏斗和无水硫酸钠层内的色素，洗涤液并入球形瓶内。（4）浓缩与定容提取液于旋转蒸发器上减压蒸发（60），蒸发至约1mL时，取下，氮气吹干，立即加入2.00mL石油醚定容，备层析用。.43（5）纸层析

26、点样：在18cm30cm滤纸下端距底边4cm处作一基线，在基线上取A、B、C、D四点，吸取0.1000.400mL浓缩液(6.3)在AB和CD间迅速点样。展开：待纸上所点样液自然挥发干后，将滤纸卷成圆筒状，置于预先用石油醚饱和的层析缸中，进行上行展开。（同时做标样）洗脱：待胡萝卜素与其他色素完全分开后，取出滤纸，自然挥发干石油醚，剪下位于展开剂前沿的胡萝卜素层析带，立即放入盛有5mL石油醚的具塞试管中，用力振摇，使胡萝卜素完全溶入溶剂中。.44（6）比色测定用1cm比色杯，以石油醚调节零点，于450nm波长下，测吸光度，以其值从标准曲线上查出胡萝卜素的含量，供计算时使用。标准曲线绘制（7）标准

27、曲线制备 取系列胡萝卜素标准使用液按样品测定步骤进行操作，点样体积为0.100mL，标准曲线各点胡萝卜素含量依次为2.50、5.00、7.50、10.00、15.00、20.00g。以胡萝卜素含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。 （8）结果计算1000110012mVVCX.45水溶性维生素的测定水溶性维生素的测定 水溶性维生素水溶性维生素B1、B2和和C，广泛存在于动植，广泛存在于动植物组织中，饮食来源充足。但是由于它们本身的物组织中，饮食来源充足。但是由于它们本身的水溶性质，除满足人体生理、生化作用外，任何水溶性质，除满足人体生理、生化作用外，任何多余量都会从小便中排出。为避免耗尽

28、，需要经多余量都会从小便中排出。为避免耗尽，需要经常地由饮食来提供。常地由饮食来提供。.46 水溶性维生素都易溶于水，而不溶于苯、乙醚、水溶性维生素都易溶于水，而不溶于苯、乙醚、氯仿等大多数有机溶剂。在酸性介质中很稳定，既氯仿等大多数有机溶剂。在酸性介质中很稳定，既使加热也不破坏；但在碱性介质中不稳定，易于分使加热也不破坏；但在碱性介质中不稳定，易于分解，特别在碱性条件下加热，可大部或全部破坏。解，特别在碱性条件下加热，可大部或全部破坏。它们易受空气、光、热、酶、金属离子等的影响；它们易受空气、光、热、酶、金属离子等的影响； 维生素维生素B2对光，特别是紫外线敏感，易被光对光，特别是紫外线敏感

29、，易被光 线破坏；线破坏； 维生素维生素C对氧、铜离子敏感，易被氧化。对氧、铜离子敏感，易被氧化。.47 根据上述性质，测定水溶性维生素时，一般根据上述性质，测定水溶性维生素时，一般都在都在酸性溶液中酸性溶液中进行前处理。进行前处理。 维生素维生素Bl、B2 盐酸水解盐酸水解 酶解酶解 提取提取 纯化纯化 维生素维生素C通常采用草酸、草酸通常采用草酸、草酸醋酸、偏磷酸醋酸、偏磷酸醋酸溶液直接提取。在一定浓度的酸性介质中，醋酸溶液直接提取。在一定浓度的酸性介质中，可以消除某些还原性杂质对维生素可以消除某些还原性杂质对维生素C的破坏作用的破坏作用。草酸价廉，使用方便，对维生素。草酸价廉，使用方便，

30、对维生素C有很好保护有很好保护作用。作用。淀粉酶、淀粉酶、木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶活性人造浮石、活性人造浮石、硅镁吸附剂硅镁吸附剂.48一、维生素一、维生素Bl的测定的测定 (GB 5009.842003 ) 维生素维生素Bl又名硫胺素、抗神经炎素，通常以又名硫胺素、抗神经炎素，通常以游离态，或以焦磷酸酯形式存在于自然界。在酵游离态，或以焦磷酸酯形式存在于自然界。在酵母、米糠、麦胚、花生、黄豆以及绿色蔬菜和牛母、米糠、麦胚、花生、黄豆以及绿色蔬菜和牛乳、蛋黄中含量较为丰富。乳、蛋黄中含量较为丰富。.49 硫胺素在碱性铁氰化钾溶液中被氧化成噻嘧色素，在紫外硫胺素在碱性铁氰化钾溶液中被氧化成噻嘧色素，

31、在紫外线下，噻嘧色素发出荧光。在给定的条件下，以及没有其他荧线下，噻嘧色素发出荧光。在给定的条件下，以及没有其他荧光物质干扰时，此荧光之强度与噻嘧色素量成正比，即与溶液光物质干扰时，此荧光之强度与噻嘧色素量成正比，即与溶液中硫胺素量成正比。中硫胺素量成正比。 本方法适用于各类食物中硫胺素的测定，但不适用于有吸本方法适用于各类食物中硫胺素的测定，但不适用于有吸附硫胺素能力的物质和含有影响噻嘧色素荧光物质的样品。附硫胺素能力的物质和含有影响噻嘧色素荧光物质的样品。本方法的最小检出限为本方法的最小检出限为0.05g。 .502. 主要试剂活性人造浮石硫胺素标准溶液3. 仪器设备荧光分光光度计Maiz

32、el-Gerson 反应瓶盐基交换管.513. 操作步骤（1）试样处理 样品匀浆（或粉碎）于低温冰箱中冷冻保存。（2）提取水解 酶解称样三角瓶三角瓶高压水解高压水解盐酸溶液盐酸溶液调调pHpH值值乙酸钠溶液乙酸钠溶液酶解酶解淀粉酶淀粉酶定容定容.52（3）净化样品样品热水热水酸性氯化钾酸性氯化钾收集酸性氯化钾定容至收集酸性氯化钾定容至25ml25ml（3）净化同时做标准溶液同时做标准溶液.53（4）氧化 静置 过滤 脱水反应瓶编号标准A瓶标准B瓶样品A瓶样品B瓶加标准液或样品液标准液5ml 标准液5ml 样品液5ml 样品液5ml加氢氧化钠3ml3ml加碱性铁氰化钾3ml3ml加正丁醇10ml

33、10ml10ml10ml.54（5）荧光强度测定激发波长365nm；发射波长435nm；激发波狭缝5nm；发射波狭缝5nm。4.计算 1000100121mVVSSVCUUXbb.55二、维生素二、维生素B2的测定的测定 维生素维生素B2即核黄素。在食品中以游离即核黄素。在食品中以游离形式或磷酸酯等结合形式存在。膳食中的形式或磷酸酯等结合形式存在。膳食中的主要来源是各种动物性食品，其中以肝、主要来源是各种动物性食品，其中以肝、肾、心、蛋、奶含量最多，其次是植物性肾、心、蛋、奶含量最多，其次是植物性食品的豆类和新鲜绿叶蔬菜。食品的豆类和新鲜绿叶蔬菜。.56维生素维生素B2又称核黄素又称核黄素测定

34、方法主要有：微生物法、荧光法、测定方法主要有：微生物法、荧光法、HPLC法法GB/T 12391-1990采用的是微生物法和荧光法。采用的是微生物法和荧光法。（一）微生物法（一）微生物法原理：原理：某一种微生物的生长某一种微生物的生长( (繁殖繁殖) )必需某些维生素。必需某些维生素。例如干酪乳酸杆菌例如干酪乳酸杆菌(Lactobacillus casei(Lactobacillus casei，简称，简称L.C.)L.C.)的生长需要核黄素，培养基中若缺乏这种维生素该细的生长需要核黄素，培养基中若缺乏这种维生素该细菌便不能生长。在一定条件下，该细菌生长情况，以菌便不能生长。在一定条件下，该细

35、菌生长情况，以及它的代谢物乳酸的浓度与培养基中该维生素含量成及它的代谢物乳酸的浓度与培养基中该维生素含量成正比，因此可以用酸度及混浊度的测定法来测定样品正比，因此可以用酸度及混浊度的测定法来测定样品中核黄素的含量。中核黄素的含量。 .57（二）荧光法（二）荧光法1.原理：原理： 核黄素在核黄素在440500nm波长光照射下发生黄绿色波长光照射下发生黄绿色荧光。在稀溶液中其荧光强度与核黄素的浓度成正比。荧光。在稀溶液中其荧光强度与核黄素的浓度成正比。在波长在波长525nm下测定其荧光强度。试液再加入低亚硫下测定其荧光强度。试液再加入低亚硫酸钠酸钠(Na2S2O4)，将核黄素还原为无荧光的物质，然

36、后，将核黄素还原为无荧光的物质，然后再测定试液中残余荧光杂质的荧光强度，两者之差即再测定试液中残余荧光杂质的荧光强度，两者之差即为食品中核黄素所产生的荧光强度。为食品中核黄素所产生的荧光强度。 为使为使VB2游离出来，采用需经酸解和酶解游离出来，采用需经酸解和酶解 为消除干扰，试样通过氧化处理和柱层析处理。为消除干扰，试样通过氧化处理和柱层析处理。 .582.测定步骤测定步骤（1）样品提取）样品提取称样三角瓶三角瓶高压水解高压水解盐酸溶液盐酸溶液调调pHpH值值氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液酶解酶解淀粉酶淀粉酶定容定容蛋白酶蛋白酶.59（2）氧化去杂）氧化去杂样品提取液样品提取液具塞试管具塞试管水水

37、双氧水双氧水冰乙酸冰乙酸高锰酸钾高锰酸钾氧化去杂氧化去杂褪色褪色.60（3）柱层析）柱层析样品液样品液水水丙酮丙酮- -乙酸乙酸- -水混合液水混合液水水收集洗脱液收集洗脱液定容至定容至10ml10ml* *标准液按相标准液按相同操作进行同操作进行.61（4）荧光测定）荧光测定激发光波长激发光波长440nm，发射光波长，发射光波长525nm，测量样品，测量样品管及标准管的管及标准管的荧光值荧光值。 待样品及标准的荧光值测量后，在各管的剩余液中加待样品及标准的荧光值测量后，在各管的剩余液中加0.1mL 20%低亚硫酸钠低亚硫酸钠溶液，立即混匀，在溶液，立即混匀，在20s内内测测出各管的荧光值，作

38、为各自的出各管的荧光值，作为各自的空白值空白值。3.计算计算 10001002fmDCSBAX.62三、维生素三、维生素C的测定的测定 维生素维生素C是一种己糖醛基酸，有抗坏血病的是一种己糖醛基酸，有抗坏血病的作用，所以又称作抗坏血酸。维生素作用，所以又称作抗坏血酸。维生素C广泛存在广泛存在于植物组织中，新鲜的水果、蔬菜，特别是枣、于植物组织中，新鲜的水果、蔬菜，特别是枣、辣椒、苦瓜、柿子叶、猕猴桃、柑桔等食品中含辣椒、苦瓜、柿子叶、猕猴桃、柑桔等食品中含量尤丰富。量尤丰富。 维生素维生素C具有较强的还原性，对光敏感，氧具有较强的还原性，对光敏感，氧化后的产物称为脱氢抗坏血酸，仍然具有生理活化

39、后的产物称为脱氢抗坏血酸，仍然具有生理活性。进一步水解则生成性。进一步水解则生成2，3 -二酮古乐糖酸，失二酮古乐糖酸，失去生理作用。去生理作用。.63根据它具有的还原性质可以测定维生素根据它具有的还原性质可以测定维生素C C的含量。常用的的含量。常用的测定方法有测定方法有（1 1）2 2，6-6-二氯靛酚法二氯靛酚法 （还原型（还原型VCVC）（2 2）2 2，4-4-二硝基苯肼法二硝基苯肼法 （总（总VCVC）（3 3）碘酸法）碘酸法（4 4）碘量法）碘量法（5 5）荧光分光光度法）荧光分光光度法.64(一一) 2，6二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法 1原理原理 还原型抗坏血酸可以还原染料还原

40、型抗坏血酸可以还原染料2，6-二氯靛酚。该二氯靛酚。该染料在酸性溶液中呈粉红色染料在酸性溶液中呈粉红色(在中性或碱性溶液中呈在中性或碱性溶液中呈蓝色蓝色)，被还原后颜色消失。，被还原后颜色消失。还原型抗坏血酸还原染料后，本身被氧化成脱氢抗还原型抗坏血酸还原染料后，本身被氧化成脱氢抗坏血酸。在没有杂质干扰时，一定量的样品提取液坏血酸。在没有杂质干扰时，一定量的样品提取液还原标准染料液的量，与样品中抗坏血酸含量成正还原标准染料液的量，与样品中抗坏血酸含量成正比。比。 见课本见课本.652 2、试剂、试剂 1%1%草酸溶液：称取草酸溶液：称取10g10g草酸，加水至草酸，加水至1000mL1000m

41、L； 2%2%草酸溶液：称草酸溶液：称20g20g草酸，加水至草酸，加水至1000mL1000mL； 维生素维生素C C标准液：准确称标准液：准确称20mgVC20mgVC溶于溶于1%1%草酸中，并稀草酸中，并稀释至释至100mL100mL，吸，吸5mL5mL于于50mL50mL容量瓶中，加入容量瓶中，加入1%1%草酸至刻草酸至刻度，此溶液每毫升含有度，此溶液每毫升含有0.02mgVC0.02mgVC； 0.02% 20.02% 2，6-6-二氯靛酚溶液：称取二氯靛酚溶液：称取2 2，6-6-二氯靛酚二氯靛酚50mg50mg，溶于，溶于200mL200mL含有含有52mg52mg碳酸氢钠的热水中，冷却后，稀碳酸氢钠的热水中，冷却后，稀释至释至250mL250mL，过滤于棕色瓶中，贮存于冰箱内，应用过，过滤于棕色瓶中，贮存于冰