透明颤菌血红蛋白基因在红色糖多孢菌株中表达及对红霉素产量的影响

1、透明颤菌血红蛋白基因在红色糖多孢菌株中表达及对红霉素产量的影响         09-08-27 11:35:00     编辑：studa20                作者：吴益民 王洪军 孙艳 吴琼 冯立 张志强 杨青 杨国平【摘要】  目的 利用已含有血红蛋白基因(vgb)的红色糖多孢基因工程重组

2、菌，探讨vgb表达产物对重组糖多孢红霉菌提高红霉素产率的影响。方法 用SDS-PAGE、Western blot方法鉴定血红蛋白，用葡萄糖浓度与总蛋白质含量比较原始菌株与重组菌株的差别。结果 红色糖多孢基因工程重组菌与原始菌株比较，重组菌株发酵过程葡萄糖浓度的变化出现在第二时段(约38h)，原始菌株达到了0.4g/L，而重组菌株只有0.25g/L；第三时段原始菌株出现了游离葡萄糖浓度高峰而重组菌株未出现。在两个菌株中生物物质浓度以总蛋白质(g/L)表示存在不同，重组菌株比原始菌株约低27%。红霉素效价，原始菌株和重组菌株分别为3.98和5.15g/L，相当于重组菌株提高红霉素体积产率约29%。

3、结论 重组红色糖多孢菌表达了透明颤菌血红蛋白，提高了红霉素产率，对解决抗生素工业和基因工程菌高密度发酵有良好的应用前景。 【关键词】  透明颤菌； 血红蛋白基因； 红色糖多孢菌； 基因重组    ABSTRACT  Objective  To study the exprssion of Vitreoscilla hemoglobin gene (vgb) in the Saccharopoblyspoura erythraea and its effect on erythromycin production.  Meth

4、od  A vgb gene was integrated into the chromosomal DNA of Sac.erythraea by electrotransformation and the recombinant Sac.erythraea was obtained. The VHb was identified with SDS-PAGE and Western blotting method. Glucose concentrations and total protein content in original Sac.erythraea and recom

5、binant strain fermentation processes were determined and compared with auto-biochemical assay. The erythromycin titers were tested with cylinder plate method. Results  At the second stage of fermentation, glucose concentration of original strain reached 0.4g/L at about 38h and that of recombina

6、nt strain was 0.25g/L; at the third stage, a glucose concentration peak appeared in original strain while none did in recombinant. The total protein content of recombinant was lower than that of original strain by 27%. The titres of erythromycin in original strain and recombinant were 3.98 and 5.15g

7、/L, respectively, i.e. the the erythromycin production of recombinant was increased by 29% compared with that of original strain.  Conclusion  vgb gene was expressed in recombinant Sac.erythraea, which increased erythromycin production and showed a bright application prospect of antibiotic

8、-gene engineering strain.    KEY WORDS  Vitreoscilla;  vgb;  Saccharopolyspora erythraea;  Gentic recombination    红霉素是由红色糖多孢菌培养液中分离出来的一种抗生素，每年的产量有数千吨。考虑到菌体进行大规模发酵培养时所处的特殊生长条件，只有在大规模的生物反应器中提高氧气的利用率，才能有效地提高红霉素的产量降低生产成本，因此，寻求能够提高细胞利用氧气能力的途径是提高红霉素产量的关键。

9、透明颤菌血红蛋白(VHb)在多种异源菌株中获得成功表达1，2，是提高细胞利用氧能力的一条新途径。本项研究将vgb基因引入红色糖多孢菌株，并在重组红色糖多孢菌株中成功地表达了血红蛋白，与原始菌株比较，在发酵过程中血红蛋白持续表达，提高了红霉素的产率，现将结果报道如下。    1  材料与方法    1.1  材料    (1)菌株与质粒  红色糖多孢菌2359(红霉素的工业生产菌)购自大连医药公司。红色糖多孢菌的基因工程重组菌(染色体中已整合了Vitreoscilla hemo

10、g-lobin gene，vgb)本实验室构建。红霉素生物检测的检定菌和藤黄微球菌(Micrococus luteus)28001购自大连医药公司。    (2)试剂  红霉素标准品购自Fluka公司。葡萄糖、正丙醇、糊精、培养基与常用化学试剂和免疫试剂均购自上海生物工程公司。    (3)仪器及设备  日本SANYO MS-3020型高压灭菌锅；美国Beckman J2-21型低温离心机；瑞士INFORS公司生产的Minifors实验室小型发酵罐和Techfors-S中试型发酵罐；宁波新芝科仪器研究所生产的超声波

11、细胞粉碎仪；惠普上海分析仪器有限公司生产的7320分光光度计。    1.2  方法    (1)重组红色糖多孢菌载体的构建与工程菌株的筛选  见文献3。    (2)透明颤菌血红蛋白基因在红色糖多孢菌中表达  将重组糖多孢红霉菌发酵培养物100ml离心，收集菌体。每克菌体加入3ml的裂解液悬浮细菌，加入溶菌酶至终浓度100g/ml，1/10体积的1% Triton X-100震荡混匀，30水浴15min，置冰浴中超声处理(功率：200300w，每次60s，间隔10s)，将裂

12、解液12000r/min离心15min，溶菌沉淀和上清中加入100l 2× SDS-PAGE缓冲液，立即进行SDS-PAGE电泳分析表达产物(分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为5%)。具体操作方法参照文献4。    (3)红色糖多孢菌的补料培养  工程菌的发酵分3级进行。取一级种子35ml在S2培养基中进行摇瓶培养，48h后转移至含3.5L S3培养基的5L的小型发酵罐中，进行二级种子培养。搅拌转速为800r/min，空气流量0.6vvm，温度34。培养过程中检测溶解氧压(DOT)、pH值和氧化还原电位的变化，并在线监测排气中的二氧化碳和氧气的浓

13、度。40h后取1.5L的二级种子转移至20L的中试型发酵罐中，发酵罐中事先加入10L浓度减半的S4发酵培养基。温度34，pH值7.1，搅拌转速初始值为700r/min，当DOT低于45%的空气饱和度时提高搅拌转速到900r/min；空气流量在前12h为0.35vvm， 然后上调至0.85vvm， 开始补料后再下调为0.7vvm；反应器上方空气压力控制在0.01MPa。发酵过程中的补料，12160h按2.4ml/(L·d)的速率补加正丙醇；25h到发酵结束区间按4.8ml/(L·d)的速率补加豆油；3090h按48ml/(L·d)的速率补加15%糊精。低流速时通过补料泵每分钟补入适当的量，高流速时可连续补料。    (4)葡萄糖浓度测定  按6、38和96h梯度时间定时取样，以生化分析仪检测葡萄糖浓度，同时设对照组。    (5)发酵液中总蛋白含量的测定  采用标准Folin