CE-SDS与SEC-HPLC比较

1、Page : 1 CE-SDS(非还原）与SEC-HPLC方法比较报告人：袁梵雨、谢敏、娄昆、陈小龙Page : 2 CE-SDS(CE-SDS(非还原法）非还原法）原理简介：原理简介：毛细管电泳是以高压直流电场为驱动力，以毛细管为分离通道。毛細管內先填充凝胶，此时凝胶会在毛細管內形成分子筛，样品依分子量的大小在毛細管內移动速度不同而进行分离，能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。Page : 3 CE-SDS(非还原）非还原）仪器组成毛细管电泳系统的基本结构包括进样、填灌毛细管电泳系统的基本结构包括进样、填灌/清洗、电流回路、毛细管清洗、电流回路、毛细管/温度温度控制、检测控制、检

2、测/记录记录/数据处理等部分。数据处理等部分。Page : 4 CE-SDS(非还原）非还原）检测器检测器Page : 5 CE-SDS(非还原）非还原）进样方式1. 流体力学进样方式流体力学进样方式 （1）进样端加压）进样端加压 （2）出口端抽真空）出口端抽真空 （3）虹吸进样）虹吸进样进样量：毛细管长度的进样量：毛细管长度的1%-2%；nL级、非常小；级、非常小；2. 电动进样方式电动进样方式毛细管一端插入样品瓶，加电压。毛细管一端插入样品瓶，加电压。3. 扩散进样扩散进样 试样通过扩散作用进入分离柱端口处。试样通过扩散作用进入分离柱端口处。Page : 6 CE-SDS(非还原）非还原）

3、工作电压的确定1、在电泳条件下，改变电压（或电流）测定对应的电流（或电压）、在电泳条件下，改变电压（或电流）测定对应的电流（或电压）2、做电压、做电压电流曲线电流曲线3、取线性关系中的最大电压（或电流），作为分离电压（或电流）。线性、取线性关系中的最大电压（或电流），作为分离电压（或电流）。线性以上的电压，焦耳热效应过大，一般不宜选用。但如果分离效率很高，就可以上的电压，焦耳热效应过大，一般不宜选用。但如果分离效率很高，就可以选用，以便加快分离速度。在做以选用，以便加快分离速度。在做CGE时，电场强度应控制在时，电场强度应控制在150400V/cm之间，否则容易导致凝胶的破坏。之间，否则容易导

4、致凝胶的破坏。电泳温度的选择电泳温度的选择，主要是指毛细管外表温度的选择与控制。温度变化不仅影电泳温度的选择，主要是指毛细管外表温度的选择与控制。温度变化不仅影响分离的重现性，而且影响分离效率。温度选择应考虑：热效应控制、重现响分离的重现性，而且影响分离效率。温度选择应考虑：热效应控制、重现性控制、分离效率控制盒分离介质对温度的限制等因素。多数情况下，在性控制、分离效率控制盒分离介质对温度的限制等因素。多数情况下，在2030之间进行电泳，就能获得良好的分离结果。之间进行电泳，就能获得良好的分离结果。Page : 7 各试剂的作用各试剂的作用SDS-MW Sample Buffer： 由于蛋白是

5、两性的，与SDS结合会使蛋白带负电荷，使其在毛细管中往正极方向移动。内参蛋白溶液：指示迁移时间的变化。碘乙酰胺：与游离巯基反应，防止其攻击二硫键导致片段增多。样品处理：样品处理：在1.5mL离心管中加入SDS-MW Sample Buffer 50L，内参蛋白溶液2L，碘乙酰胺溶液10L振荡混匀。取供试品溶液（2.5mg/L）40L，振荡混匀。将离心管置于70水浴加热10min，再次振荡混匀，室温冷却。3000rpm离心60s，取上清液90L至PCR管中。CE-SDS(CE-SDS(非还原）非还原）Page : 8 2010版中国药典对仪器的一般要求：版中国药典对仪器的一般要求：毛细管：弹性石

6、英毛细管，内径50m和75 m使用较多。根据分离度要求，可选用20cm-100cm长度。CE-SDS(CE-SDS(非还原）非还原）直流高压电源：直流高压电源：采用采用0-30kV（或相近）可调节直流电源，可供应约（或相近）可调节直流电源，可供应约300 A电电流。具有稳压和稳流两种方式可供选择。流。具有稳压和稳流两种方式可供选择。冲洗进样系统：冲洗进样系统：每次进样之前毛细管要用不同溶液冲洗。进样方式有压力进每次进样之前毛细管要用不同溶液冲洗。进样方式有压力进样，负压进样，虹吸进样和样，负压进样，虹吸进样和电动进样电动进样。通过控制压力或电压及时间来控制进。通过控制压力或电压及时间来控制进样

7、量。样量。检测系统：检测系统：将毛细管接近出口端的外层聚合物剥去将毛细管接近出口端的外层聚合物剥去2mm一段，使石英壁裸露一段，使石英壁裸露，毛细管一侧放置一个石英聚光球，使光源聚集在毛细管上，透过毛细管达，毛细管一侧放置一个石英聚光球，使光源聚集在毛细管上，透过毛细管达到光电池。对无光吸收或荧光的溶质的检测，还可采用间接测定法，即在操到光电池。对无光吸收或荧光的溶质的检测，还可采用间接测定法，即在操作缓冲液中加入对光有吸收或荧光的添加剂，在溶质到达检测窗口时出现反作缓冲液中加入对光有吸收或荧光的添加剂，在溶质到达检测窗口时出现反方向的峰。方向的峰。Page : 9 对电泳实验的影响因素 缓冲

8、液pH：pH能影响样品的解离能力，样品在极性强的介质中离解度增大，电泳速度也随之增大，从而影响分离选择性和分离灵敏度。 CE-SDS(非还原）非还原）高电压高电压低电压低电压优点优点是实现是实现CE快速、高效的前提，电压升高，样品的快速、高效的前提，电压升高，样品的迁移加大，分析时间缩短迁移加大，分析时间缩短分离电压越低，分离效果越好分离电压越低，分离效果越好缺点缺点毛细管中焦耳热增大，基线稳定性降低，灵敏度毛细管中焦耳热增大，基线稳定性降低，灵敏度降低降低分析时间延长，峰形变宽，导致分离效分析时间延长，峰形变宽，导致分离效率降低率降低 分离电压： 温度 ：温度影响分离重现性和分离效率。温度升

9、高，缓冲液粘度 降低，分析时间减短，分析效率提高。但温度过高，会引起毛细管柱内 径向温差增大，焦耳热效应增强，柱效降低，分离效率也会降低。 Page : 10 SEC-HPLCSEC-HPLC体积排阻色谱(SEC)是利用多孔凝胶固定相的独特特性，而产生的一种主要依据分子尺寸大小的差异来分离的液相色谱方法。简介：简介：分离机理：分离机理：固定相是多孔性凝胶，大分子大分子不能进入凝胶孔洞而完全被排阻，只能沿多孔凝胶粒子之间的空隙通过色谱柱，首先被洗脱出来；中等大小的分中等大小的分子子能进入凝胶中一些适当的孔洞中，但不能进入更小的微孔，在柱中受到滞留，较慢地被洗脱出来；小分子小分子可进入凝胶中绝大部

10、分孔洞，在柱中受到更强的滞留，会更慢地被洗脱出。Page : 11 图示Page : 12 仪器：高效液相色谱仪需定期检定，周期为1年。SEC-HPLCSEC-HPLC2010版中国药典版中国药典对仪器的一般要求和色谱条件对仪器的一般要求和色谱条件色谱柱：多使用凝胶或亲水刚性、多孔微球、机械强度好的聚合物等填充物使用水或缓冲盐作为流动相，流动相的pH值一般控制在28之间。流速一般在0.51.0ml/min检测器：常用UV（紫外-可见）检测器，检测波长通常为280nm。Page : 13 SEC-HPLC 柱效率N：色谱柱的效率可借用“理论塔板数”N进行描述。 分离度分离度R：判断物质在色谱柱中

11、的分离情况：判断物质在色谱柱中的分离情况,常作为柱的总分离效能指标。常作为柱的总分离效能指标。 式中，式中，tR1， tR2分别为对应于峰分别为对应于峰1和峰和峰2的保留时间；的保留时间； W1，W2分别为峰分别为峰1和峰和峰2的峰底宽的峰底宽色谱柱性能评价的两个重要参数N=16(tR/W)2 =5.54(tR/W1/2)2tR 为保留时间；为保留时间；W代表峰宽；代表峰宽；W1/2 ：半高峰宽，通过峰高的中点作平行于：半高峰宽，通过峰高的中点作平行于峰底的直线，此直线与峰两侧相交两点之间的距离。峰底的直线，此直线与峰两侧相交两点之间的距离。R=2(tR2-tR1)/(W1+W2) Page

12、: 14 SEC-HPLC 色谱柱填料的孔径大小及其粒径分布均匀性 孔径太小，待测物不易流出，分析时间长，展宽严重 。孔径太大则很可能导致组分分不开。在做凝胶色谱时，先大致估计下待分析物的分子量，然后选择合适的柱子，如果不知道粒径，可先用大孔径的先试试，接着再用小粒径的以达到更高的精度。 流动相 凝胶色谱中流动相的影响不像别的色谱（如反相or离子色谱)那么明显。其中主要影响的是流动相的流速，一般流速越大，出峰越快，但分离效果可能不是很好。 色谱柱高度和直径 色谱柱越长，样品组分分的越开，但过长时会消耗太多的溶剂，而且柱展宽等也容易变的严重。色谱柱直径太大时，样品沿径向的分布容易不均匀，容易出现

13、柱中心处比柱四周跑的快，从而增加了展宽。影响色谱分离因素Page : 15 两种检测方法的结果评定实验方法实验方法系统适用性系统适用性样品样品SEC-HPLC1.参考品主峰面积百分比参考品主峰面积百分比RSD2%2.参考品保留时间参考品保留时间SD0.2min3.参考品理论塔板数参考品理论塔板数2000参照以往样品和本次系统适参照以往样品和本次系统适应性条件而定应性条件而定CE-SDS内参峰出峰时间内参峰出峰时间4.35.3min参考品纯度在首次检测结果参考品纯度在首次检测结果的的1%范围内。范围内。内参峰出峰时间内参峰出峰时间4.35.3minPage : 16 抗体结构IgGPage :

14、17 HLHHHHLMinutes02468101214AU0.000.050.10(Peak 4.817 Minutes)LCHCHLHHHHLIgG PDA - 220nmDP(light,49h)_GB232-20121102NameLCHCPage : 18 Minutes02468101214AU0.000.050.10(Peak 4.817 Minutes)LCHCHLHHHHLIgG PDA - 220nmDP(light,49h)_GB232-20121102NameMinutes02468101214AU0.000.050.10(Peak 4.825 Minutes)LCHL

15、HHHHLIgGPDA - 220nmDP(dark,49h)_GB232-20121102NameHMW(11.9%)HMW(7.4%)HMW（0.9%）Page : 19 两种方法例证比较批号批号试验点试验点面积百分比结果面积百分比结果(%)CE-SDSSEC-HPLCHMWIgGLMWHMWMain PeakLMWGB232-201211020点点097.432.570.799.10.140，10天天096.013.991.496.62.040，20天天0.2794.635.101.795.62.740，30天天0.3193.336.361.994.83.3Page : 20 SEC-HPLC示例图如下示例图如下CE-SDSDP(40，30天)_GB232-20121102DP(40，20天)_GB232-20121102DP(40，10天)_GB232-20121102DP_GB232-20121102HMWLMWPage : 21 总结：总结：实验方法检测时间准备时间样品量进样量分离效果SEC-HPLC16min1.5hNA30g/100g在分子量大的范围内分离效果相对比较好CE-SDS41