分子生物学第11章转录前的基因活化

1、11.1 DNA水平的调控水平的调控11.2 染色质结构与基因活化染色质结构与基因活化11.3 核基质附着区与基因表达核基质附着区与基因表达11.4 DNA甲基化在调节基因表达中的作用甲基化在调节基因表达中的作用11 转录前的基因活化基因表达调控的层次 基因表达受发育阶段及环境因素的影响。基因表达受发育阶段及环境因素的影响。生物体对基因表达的调控有许多的层次，如生物体对基因表达的调控有许多的层次，如转录前的基因活化、转录过程、转录后的转录前的基因活化、转录过程、转录后的RNA加工成熟过程、翻译过程、翻译后的多加工成熟过程、翻译过程、翻译后的多肽加工过程。这些过程对于生物生长发育是肽加工过程。这

2、些过程对于生物生长发育是非常重要的。非常重要的。 DNA 水平的调控 某些原生动物、线虫和甲壳类动物在个体发某些原生动物、线虫和甲壳类动物在个体发育中，体细胞会发生染色体丢失现象，只有将来育中，体细胞会发生染色体丢失现象，只有将来分化形成生殖细胞的那些细胞才保持完整的基因分化形成生殖细胞的那些细胞才保持完整的基因组。组。 目前在高等真核生物（包括动、植物）中尚目前在高等真核生物（包括动、植物）中尚未发现类似的基因丢失现象。未发现类似的基因丢失现象。 基因丢失基因丢失基因丢失 马蛔虫受精卵里只有一对染色体（马蛔虫受精卵里只有一对染色体（2n = 2），），当个体发育到一定阶段后，在将分化为体细胞

3、的当个体发育到一定阶段后，在将分化为体细胞的那些细胞中，这对染色体破碎成许多小染色体。那些细胞中，这对染色体破碎成许多小染色体。有的小染色体具有着丝粒，在细胞分裂中得到保有的小染色体具有着丝粒，在细胞分裂中得到保留，不具有着丝粒的小染色体因为在以后的细胞留，不具有着丝粒的小染色体因为在以后的细胞分裂中不能分配到下一代细胞中而丢失，在将形分裂中不能分配到下一代细胞中而丢失，在将形成生殖细胞的那些细胞里却没有染色体破碎和丢成生殖细胞的那些细胞里却没有染色体破碎和丢失现象。这些基因的丢失决定了细胞的命运。失现象。这些基因的丢失决定了细胞的命运。 基因丢失（续） 许多原生动物细胞中（纤毛虫纲的草履虫、

4、许多原生动物细胞中（纤毛虫纲的草履虫、钟虫等）含有两种类型的核，小核和大核。通常钟虫等）含有两种类型的核，小核和大核。通常在它们的生殖细胞中只具有一个小核，当细胞分在它们的生殖细胞中只具有一个小核，当细胞分化时，小核经历各种变化，最终结果是产生拥有化时，小核经历各种变化，最终结果是产生拥有一个大核和一个小核的双核细胞。小核中含有无一个大核和一个小核的双核细胞。小核中含有无活性的活性的DNA，仅仅为将来产生生殖细胞贮藏遗传，仅仅为将来产生生殖细胞贮藏遗传信息；大核中的信息；大核中的DNA则是具有转录活性的模板。则是具有转录活性的模板。 基因丢失（续） 在对原生动物在对原生动物Oxytrichia

5、的大核形成过程的研的大核形成过程的研究中发现，处于生殖细胞中的小核究中发现，处于生殖细胞中的小核DNA，在分化，在分化过程中被切割成长度为过程中被切割成长度为50020000bp的线性片段，的线性片段，而且大部分而且大部分DNA在形成上述线性片段的过程中被在形成上述线性片段的过程中被彻底降解。通过一种目前还不清楚的方式，剩下的彻底降解。通过一种目前还不清楚的方式，剩下的片段能够不断复制，直到每个细胞中含有片段能够不断复制，直到每个细胞中含有17000种种不同片段的不同片段的1000个拷贝为止。这些片段进一步建成个拷贝为止。这些片段进一步建成大核。在这个过程中，大核所含的大核。在这个过程中，大核

6、所含的DNA是小核是小核DNA的几百倍，但是丢失了一半以上的小核的几百倍，但是丢失了一半以上的小核DNA序列。序列。 DNA 水平的调控 基因扩增基因扩增 基因扩增是指细胞内某些特定基因的拷贝数基因扩增是指细胞内某些特定基因的拷贝数专一性地大量增加的现象，它是通过改变基因的专一性地大量增加的现象，它是通过改变基因的数量而调节基因表达的一种调控方式。当发育分数量而调节基因表达的一种调控方式。当发育分化或环境条件改变，使对某种基因产物的需要量化或环境条件改变，使对某种基因产物的需要量剧增，单靠调节表达活性不足以满足需要时，依剧增，单靠调节表达活性不足以满足需要时，依靠基因扩增可迅速增加基因表达产物

7、的量。靠基因扩增可迅速增加基因表达产物的量。 基因扩增（续） 在两栖类和昆虫的卵母细胞中，为贮备大量核在两栖类和昆虫的卵母细胞中，为贮备大量核糖体以供胚胎早期发育的需要，通常专一性地扩增糖体以供胚胎早期发育的需要，通常专一性地扩增rRNA基因。非洲爪蟾体细胞基因。非洲爪蟾体细胞rDNA拷贝数约拷贝数约500个，个，而卵母细胞中而卵母细胞中rDNA的拷贝数可达的拷贝数可达2百万个，以染色百万个，以染色体外环状体外环状DNA分子的形式存在，每个环状分子的形式存在，每个环状DNA分分子含子含24个甚至多达个甚至多达16个个rRNA基因。这些基因。这些rDNA约约占整个卵母细胞占整个卵母细胞DNA的的

8、75%。当胚胎期开始时，这。当胚胎期开始时，这些染色体外扩增的环状些染色体外扩增的环状rDNA拷贝即失去功能并逐拷贝即失去功能并逐渐消失。渐消失。 基因扩增（续） 外界环境因素也可以造成基因扩增。用二氢叶外界环境因素也可以造成基因扩增。用二氢叶酸还原酶的抑制剂氨甲喋呤处理离体培养的细胞系，酸还原酶的抑制剂氨甲喋呤处理离体培养的细胞系，可以使这个酶的基因可以使这个酶的基因 dhfr 扩增达到扩增达到40400个拷贝，个拷贝，从而产生更高的酶活性来增加对氨甲喋呤的抗性。从而产生更高的酶活性来增加对氨甲喋呤的抗性。基因扩增了的细胞系可分为两大类：一类是稳定系基因扩增了的细胞系可分为两大类：一类是稳定

9、系（stable lines），无论是否除去氨甲喋呤，扩增的），无论是否除去氨甲喋呤，扩增的d h f r 基 因 都 依 然 存 在 ； 另 一 类 是 不 稳 定 系基 因 都 依 然 存 在 ； 另 一 类 是 不 稳 定 系（unstable lines），扩增的），扩增的dhfr基因在除去氨甲喋基因在除去氨甲喋呤后逐渐消失。呤后逐渐消失。基因扩增（续） 稳定系中扩增的稳定系中扩增的 dhfr 基因成簇串联在一起，基因成簇串联在一起，位于一条染色体原来的位于一条染色体原来的 dhfr 基因位置上，而其同基因位置上，而其同源染色体的源染色体的 dhfr 基因通常不扩增。不稳定系中扩基因通

10、常不扩增。不稳定系中扩增的增的 dhfr 基因以双小染色体（基因以双小染色体（double-minute chromosomes）的形式存在，每个双小染色体含）的形式存在，每个双小染色体含有有24个个 dhfr 基因，双小染色体可以自主复制，基因，双小染色体可以自主复制，但无着丝点，在有丝分裂中不能均等地分配到子但无着丝点，在有丝分裂中不能均等地分配到子细胞中去，并常常因此而丢失。细胞中去，并常常因此而丢失。DNA 水平的调控基因重排基因重排 基因重排是改变基因组中有关基因序列结基因重排是改变基因组中有关基因序列结构的一种基因表达调控方式。一个最典型的例构的一种基因表达调控方式。一个最典型的例

11、子是人和哺乳动物在子是人和哺乳动物在B淋巴细胞分化期间发生淋巴细胞分化期间发生基因组重建，从而产生抗体的多样性，以识别基因组重建，从而产生抗体的多样性，以识别和区分不同结构的抗原。和区分不同结构的抗原。 基因重排 抗体分子中最主要的抗体分子中最主要的IgG是由两条轻链和是由两条轻链和两条重链组成。轻链和重链由两条重链组成。轻链和重链由3个独立的多基个独立的多基因家族编码，其中两个编码轻链（因家族编码，其中两个编码轻链（和和），），一个编码重链。一个编码重链。基因重排 小鼠的小鼠的、和重链的基因家族分别位于第和重链的基因家族分别位于第6、12和和16号染色体上。决定轻链的基因族上分别由号染色体上

12、。决定轻链的基因族上分别由L、V、J、C四类基因片段，四类基因片段，L代表前导片段代表前导片段（leader segment），），V代表可变片段（代表可变片段（variable segment），），J代表连接片段（代表连接片段（joining segment），），C代表恒定片段（代表恒定片段（constant segment）。决定重链）。决定重链的基因族上共有的基因族上共有L、V、D、J、C五类基因片段，五类基因片段，其中其中D代表多样性片段（代表多样性片段（diversity segment）。）。 基因重排 小鼠的重链和小鼠的重链和链基因族各有链基因族各有V片段约片段约200个，个

13、，链的链的V片段有片段有5个；个；J片段有片段有5个；个；D片段有片段有12个。个。人的抗体基因族结构大体相似，但分布在不同染人的抗体基因族结构大体相似，但分布在不同染色体上。当淋巴细胞受到抗原刺激而分化为浆细色体上。当淋巴细胞受到抗原刺激而分化为浆细胞时，胚原型胞时，胚原型DNA将发生基因重排而形成表达型将发生基因重排而形成表达型DNA。重链取一个。重链取一个V、D、J与与L、C重排成表达重排成表达型型DNA，而将其它的，而将其它的V、D、J切除；同样轻链也切除；同样轻链也取一个取一个V、J与与L、C重排。这样每一种淋巴细胞重排。这样每一种淋巴细胞能且仅能产生一种抗体。能且仅能产生一种抗体。

14、 鼠胚系Ig基因的构成人胚系Ig基因的构成小鼠Ig重链的基因重排、转录与合成的顺序小鼠Ig重链的基因重排、转录与合成的顺序（续）小鼠Ig轻链的基因重排、转录与合成的顺序小鼠Ig重链的基因重排、转录与合成的顺序（续）图图111 真核生物染色体的组装模式真核生物染色体的组装模式常染色质和异染色质 常染色质是间期核内凝缩程度相对较低的染常染色质是间期核内凝缩程度相对较低的染色质区，异染色质是凝缩程度相对较高的染色质色质区，异染色质是凝缩程度相对较高的染色质区。按其功能来分，根据其是否转录区域，还可区。按其功能来分，根据其是否转录区域，还可以将染色质分为活性染色质和非活性染色质，异以将染色质分为活性染

15、色质和非活性染色质，异染色质中都是非活性染色质。常染色质中一部分染色质中都是非活性染色质。常染色质中一部分是活性染色质，一部分是非活性染色质。活性染是活性染色质，一部分是非活性染色质。活性染色质伸展成念珠状，有些地方还与组蛋白分离。色质伸展成念珠状，有些地方还与组蛋白分离。 DNase 超敏感位点 用极低浓度的用极低浓度的DNase对染色质进行切割，对染色质进行切割，能够被切割的位点称为能够被切割的位点称为DNase超敏感位点。超敏感位点。 DNase 超敏感位点位于活性染色质区。在活性超敏感位点位于活性染色质区。在活性染色质区，由于染色质区，由于DNA裸露，易受裸露，易受DNase 切割。切

16、割。有些有些DNase 超敏感位点是一个短的区域，即超敏感位点是一个短的区域，即30nm纤维为序列特异调节蛋白结合所中断的区域；纤维为序列特异调节蛋白结合所中断的区域；有些有些DNase 超敏感位点是一些较长的区域，即超敏感位点是一些较长的区域，即转录正在进行的区域。异染色质对转录正在进行的区域。异染色质对DNase不敏不敏感。感。 常染色质，示活性染色质和非活性染色质及DNase超敏感位点非活性染色质非活性染色质活性染色质活性染色质极低浓度极低浓度DNase能够切割的位点能够切割的位点称为称为DNase超敏感位点。超敏感位点。成串的非甲基化的成串的非甲基化的CpG序列称为序列称为CpG岛岛H

17、1组蛋白的修饰 H1组蛋白结合在核小体组蛋白结合在核小体DNA进出口处，并进出口处，并在形成二级结构在形成二级结构30nm螺线管时起重要作用。当螺线管时起重要作用。当在在H1组蛋白特异的氨基酸残基上发生磷酸化时，组蛋白特异的氨基酸残基上发生磷酸化时，染色质凝缩，使该区域成为异染色质。关闭该染色质凝缩，使该区域成为异染色质。关闭该区段的基因表达。区段的基因表达。 核心组蛋白修饰 核心组蛋白修饰后会影响它们与核心组蛋白修饰后会影响它们与DNA的结合，的结合，修饰作用包括乙酰化、磷酸化和甲基化。其中核修饰作用包括乙酰化、磷酸化和甲基化。其中核心组蛋白赖氨酸残基被乙酰化后，减少了组蛋白心组蛋白赖氨酸残

18、基被乙酰化后，减少了组蛋白的正电荷，降低了与的正电荷，降低了与DNA的结合力。活性染色质的结合力。活性染色质往往是高度乙酰化的。往往是高度乙酰化的。非组蛋白修饰 非组蛋白中包括各种转录因子（反式作用非组蛋白中包括各种转录因子（反式作用因子），它们的活性也会受到修饰调节。因子），它们的活性也会受到修饰调节。在非组蛋白中有一类，由于其在电泳中的高迁在非组蛋白中有一类，由于其在电泳中的高迁移率，故称为高迁移率蛋白（移率，故称为高迁移率蛋白（high mobility group, HMG），它们常与活性染色质结合，），它们常与活性染色质结合，并与转录效率升高相联系。并与转录效率升高相联系。 核基质

19、染色质可用盐、中性去垢剂和染色质可用盐、中性去垢剂和Dnase等化等化学方法和电泳等物理方法来提取。提取后残留学方法和电泳等物理方法来提取。提取后残留的结构，即为核基质（的结构，即为核基质（nuclear matrix），也），也称核骨架（称核骨架（nuclear scaffold）。核基质的主要）。核基质的主要成分是蛋白质。成分是蛋白质。 间期染色质提取后残留的核基质是一种有间期染色质提取后残留的核基质是一种有着不同密度的纤维状网。着不同密度的纤维状网。 基质附着区 真核生物的染色体是由周期性紧密结合在真核生物的染色体是由周期性紧密结合在核基质上的核基质上的DNA环组成的。环组成的。DNA上

20、与核基质结上与核基质结合 的 那 段 序 列 称 为 基 质 附 着 区 （合 的 那 段 序 列 称 为 基 质 附 着 区 （ m a t r i x attachment regions，MARs），或称为基质结），或称为基质结合区（合区（matrix association regions，MARs）。）。MARs之间的环约为之间的环约为5200kb左右。如果以间期左右。如果以间期染色质平均染色质平均85kb有一个环来计算，具有有一个环来计算，具有109核苷核苷酸对的二倍体细胞应有酸对的二倍体细胞应有23,000个个MARs。 基质附着区（续） 现有的研究表明，现有的研究表明，MARs

21、序列缺少保守性，序列缺少保守性，它们通常含有约它们通常含有约 70% 的的 A + T ，除此之外缺少，除此之外缺少共有序列。不同来源的共有序列。不同来源的MARs之间不能相互杂之间不能相互杂交，但可以与不同来源的核基质结合，说明其交，但可以与不同来源的核基质结合，说明其序列同源性虽差，但在功能进化上却是保守的。序列同源性虽差，但在功能进化上却是保守的。图图113 MAR与核基质的相互作用与核基质的相互作用图图114 活体或离体两种方法检测活体或离体两种方法检测MAR（1）与核基质结合活体方法活体方法离体方法离体方法图图114 活体或离体两种方法检测活体或离体两种方法检测MAR（2） 提取的提

22、取的DNA跑两跑两个 泳 道 ， 用个 泳 道 ， 用 特 异 的特 异 的DNA探针检测其中一探针检测其中一个泳道，看是否有特个泳道，看是否有特异的异的MAR片段片段活体方法活体方法离体方法离体方法 MARs在基因表达中的作用 MARs在基因表达中可能有在基因表达中可能有4种作用：种作用： 边界元件作用，它确定了独立的基因调节区域。边界元件作用，它确定了独立的基因调节区域。 染色质调节作用，染色质调节作用，MARs作为刺激或阻遏基因表作为刺激或阻遏基因表 达的顺式作用元件，可促进调节蛋白的结合和达的顺式作用元件，可促进调节蛋白的结合和 作用。作用。 作为作为DNA复制起点的组成起作用。复制起

23、点的组成起作用。 对于有丝分裂中期染色体的组装并保持一定形状对于有丝分裂中期染色体的组装并保持一定形状 是重要的。是重要的。 图图117 侧向构建有侧向构建有MAR的转的转基因形成独立活性结构区基因形成独立活性结构区MARs的边界作用 图图116 基质附着区（基质附着区（MARs）功能分析）功能分析1kb DNA云扁豆蛋白基因云扁豆蛋白基因增强子不能促进表达增强子不能促进表达增强子激活了表达增强子激活了表达MARs的边界作用 MARs 的调节作用 当用一个异源的酵母当用一个异源的酵母ARS1 MAR作为侧翼的作为侧翼的GUS（葡糖苷酸酶）报告基因转入烟草细胞，葡糖苷酸酶）报告基因转入烟草细胞，

24、使报告基因的表达水平提高了使报告基因的表达水平提高了12倍，最高达倍，最高达24倍。倍。而改用来自烟草内源的与核基质结合较强的而改用来自烟草内源的与核基质结合较强的R67 MAR替换上述与核基质结合较弱的酵母替换上述与核基质结合较弱的酵母ARS1 MAR时，时，GUS的表达水平提高了的表达水平提高了60倍，最高达倍，最高达140倍。这说明与核基质结合力较强的倍。这说明与核基质结合力较强的MAR比结合力比结合力较弱的较弱的MAR对基因表达的影响较大。对基因表达的影响较大。 MARs 的调节作用（续） 在对番茄热激蛋白基因表达的研究中发现，在对番茄热激蛋白基因表达的研究中发现，只有在只有在3MAR

25、、5MAR及内含子均存在的情况及内含子均存在的情况下基因正常表达，缺少其中一个将大大降低基下基因正常表达，缺少其中一个将大大降低基因表达。这说明基因侧翼的因表达。这说明基因侧翼的MARs和内含子对和内含子对于基因表达的调控有关。于基因表达的调控有关。 DNA甲基化 在真核生物在真核生物DNA中，甲基化发生在胞苷酸残基中，甲基化发生在胞苷酸残基胞嘧啶环的胞嘧啶环的5位碳原子上。甲基化位点通常在位碳原子上。甲基化位点通常在CG序序列上。对于植物来说，甲基化还能在列上。对于植物来说，甲基化还能在CNG序列的序列的C上发生。上发生。 CG CNG GC GNC 在上述序列中，如果一个位点上只有一条链的

26、在上述序列中，如果一个位点上只有一条链的C被甲基化，称为半甲基化；如果一个位点两条链被甲基化，称为半甲基化；如果一个位点两条链的的C都被甲基化，称为完全甲基化。都被甲基化，称为完全甲基化。 一般认为，高度甲基化的区域是不转录区域。一般认为，高度甲基化的区域是不转录区域。 DNA甲基化的作用 甲基化能防止相关限制酶的切割作用，还能甲基化能防止相关限制酶的切割作用，还能阻碍调节蛋白与之结合，在基因启动子和编码区阻碍调节蛋白与之结合，在基因启动子和编码区的甲基化可能抑制转录。的甲基化可能抑制转录。 植物植物DNA甲基化主要存在于核基因组。甲基化主要存在于核基因组。 限制性内切酶对甲基化和非甲基化CCGG的切割 图图119 DNA复制时甲基化类型的传递复制时甲基化类型的传递不对称序列的甲基化，新合成的子链不甲基化。不对称序列的甲基化，新合成的子链不甲基化。 DNA甲基化与基因表达 高度甲基化基因的表达受到抑制。由于不同高度甲基化基因的表达受到抑制。由于不同的基因在不同的器官或不同的发育阶段表达，其的基因在不同的器官或不同的发育阶段表达，其甲基化状况也发生相应的变化。如雌性哺乳动物甲基化状况也发生相应的变化。如雌性哺乳动物的一条的一条X染色体高度甲基化，而以非活性状态存在；染色体高度甲基化，而以非活性状态存在；珠蛋白基因在红细胞中是低甲