干扰素的质量分析

1、干扰素干扰素的质量分析的质量分析项项 目目 三三基基 本本 信信 息息干扰素（干扰素（IFN）是一种广谱抗病毒剂，）是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制并不直接杀伤或抑制病毒病毒，而主要是，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制乙肝病毒的复制；同时还可增强自然杀伤细而抑制乙肝病毒的复制；同时还可增强自然杀伤细胞（胞（NK细胞）、巨噬细胞和细胞）、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。 1957年，英国病毒生物学家和瑞士研究人员，在利用鸡胚年，英

2、国病毒生物学家和瑞士研究人员，在利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感干扰现象时了解到，病毒感染的细胞绒毛尿囊膜研究流感干扰现象时了解到，病毒感染的细胞能产生一种因子，后者作用于其他细胞，干扰病毒的复制，能产生一种因子，后者作用于其他细胞，干扰病毒的复制，故将其命名为干扰素。故将其命名为干扰素。1966-1971年，年，Friedman发现了干扰素的抗病毒机制。发现了干扰素的抗病毒机制。 1980-1982年，科学家用基因工程方法在年，科学家用基因工程方法在大肠杆菌及酵母菌细胞内获得了干扰素。大肠杆菌及酵母菌细胞内获得了干扰素。基基 本本 信信 息息根据干扰素蛋白质的氨基酸结构、抗原性和细胞来源，根据干扰

3、素蛋白质的氨基酸结构、抗原性和细胞来源，可将其分为：可将其分为：IFN-、IFN-、IFN-。干扰素干扰素(尤其是尤其是-干扰素及干扰素及-干扰素干扰素)除具有抗病毒、除具有抗病毒、免疫调节的作用外，还具有明显的抗细胞增殖作用。免疫调节的作用外，还具有明显的抗细胞增殖作用。因此，目前干扰素已被用于治疗多种白血病。因此，目前干扰素已被用于治疗多种白血病。基基 本本 信信 息息干扰素干扰素1b 原液的检定原液的检定 干扰素干扰素1b 成品的检定成品的检定工工 作作 任任 务务 分分 解解干扰素干扰素1b1b（原液）的质量标准（原液）的质量标准检测项目（原液）检测项目（原液）检测方法检测方法质量标准

4、质量标准效价效价蛋白质含量蛋白质含量比活性比活性SDS-PAGE纯度纯度HPLC纯度纯度相对分子质量相对分子质量外源性外源性DNA残留量残留量IgG残留量残留量细胞病变抑制法（细胞病变抑制法（WISH细胞细胞/VSV病毒）病毒）福林酚法福林酚法效价效价/蛋白含量蛋白含量非还原非还原SDS-PAGEHPLC还原性还原性SDS-PAGE固相斑点杂交法固相斑点杂交法酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验无无无无1.0 010107 7IU/IU/mgmg蛋白质蛋白质95.0%0%95.0%0%19400 010%10%10ng/10ng/剂量剂量100ng/剂量剂量干扰素干扰素1b1b（原液）的质量标准（

5、原液）的质量标准检测项目（原液）检测项目（原液）检测方法检测方法质量标准质量标准宿主菌蛋白残留量宿主菌蛋白残留量残余抗生素活性残余抗生素活性细菌内毒素含量细菌内毒素含量等电点等电点紫外光谱扫描紫外光谱扫描肽图肽图N末端氨基酸序列末端氨基酸序列酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验抑菌圈法抑菌圈法凝胶限量实验凝胶限量实验等电聚焦电泳等电聚焦电泳紫外光谱扫描紫外光谱扫描胰蛋白酶裂解后，胰蛋白酶裂解后，RP-HPLC法测定法测定Edman降解法降解法总蛋白的总蛋白的0.1%阴性阴性10EU/30万万IU4.06.5最大吸收波长应为最大吸收波长应为2783nm，应符合应符合IFN-1b的图形，的图形，或与对

6、照品图形一致或与对照品图形一致CDLPETHSLDNRRTL干扰素干扰素1b 1b （成品）的质量标准（成品）的质量标准检测项目检测项目检测方法检测方法质量标准质量标准鉴别实验鉴别实验外观外观水分水分pH值值效价测定效价测定无菌试验无菌试验异常毒性实验异常毒性实验 抗病毒活性中和抗病毒活性中和试验或免疫印迹试验或免疫印迹肉眼观察肉眼观察费休实验费休实验电位法电位法细胞病变抑制法细胞病变抑制法直接接种培养直接接种培养小白鼠试验小白鼠试验 阳性阳性略略3.0%6.57.5应为标示量的应为标示量的80%-150%无菌生长无菌生长无明显异常反应，动物健存，无明显异常反应，动物健存，体重增加体重增加 （

7、1 1）显色反应）显色反应 茚三酮反应、福林茚三酮反应、福林酚反应、双缩脲反应均可用来鉴别酚反应、双缩脲反应均可用来鉴别干扰素。干扰素。（一）干扰素（一）干扰素的鉴别试验的鉴别试验（2 2）紫外吸收）紫外吸收 由于组成蛋白质的由于组成蛋白质的氨基酸中，酪氨酸、色氨酸、苯丙氨基酸中，酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸在紫外区有光吸收，可用来鉴氨酸在紫外区有光吸收，可用来鉴别干扰素。别干扰素。 （一）干扰素（一）干扰素的鉴别试验的鉴别试验干扰素（蛋白质）的颜色反应干扰素（蛋白质）的颜色反应 1.1.茚三酮反应：茚三酮反应：酸性条件下，与茚三酮共热产生蓝紫色。OOOHON+紫色紫色-CO2，-RCHO-3H2

8、O互变异构互变异构干扰素（蛋白质）的颜色反应干扰素（蛋白质）的颜色反应 2.2.双缩脲反应：双缩脲反应：碱性溶液中与Cu2+产生紫红色。可用于蛋白质的定性和定量分析，及检查蛋白质的水解程度。 干扰素（蛋白质）的颜色反应干扰素（蛋白质）的颜色反应 3.酚试剂反应：酚试剂反应：蛋白质中酪氨酸、色氨酸与酚试剂反应显蓝色。福林福林-酚试剂法（酚试剂法（Lowry法）法）: 碱性碱性+Cu2+磷钼酸磷钼酸-磷钨酸磷钨酸蓝色蓝色 范围范围:25-250g(Tyr,Trp的反应的反应)4.4.与与2,4-2,4-二硝基氟苯反应（二硝基氟苯反应（DNFBDNFB） 氨基酸能与氨基酸能与2,4-二硝基氟苯发生反

9、应生成二硝基氟苯发生反应生成N-2,4-二硝基苯基氨基酸。二硝基苯基氨基酸。 由于由于产物显黄色产物显黄色，所以此反应可以用于氨基酸，所以此反应可以用于氨基酸的比色测定。此外，的比色测定。此外， 2,4-二硝基氟苯是标记多肽二硝基氟苯是标记多肽N-端氨基酸的试剂。端氨基酸的试剂。知识拓展知识拓展免疫印迹法免疫印迹法 （基因重组多肽类药物的鉴别）（基因重组多肽类药物的鉴别）基本原理是借助聚丙烯酰胺凝胶技基本原理是借助聚丙烯酰胺凝胶技术，将生物活性物质高效分离，再术，将生物活性物质高效分离，再与固相免疫学方法相结合。与固相免疫学方法相结合。 知识拓展知识拓展免疫印迹法免疫印迹法 （基因重组多肽类药

10、物的鉴别）（基因重组多肽类药物的鉴别）基本操作包括三个部分：基本操作包括三个部分：聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺电泳法；转移电泳即将凝胶中的多肽电泳法；转移电泳即将凝胶中的多肽条带转移到硝酸纤维素纸上；检测或条带转移到硝酸纤维素纸上；检测或鉴定薄膜上的多肽条带。鉴定薄膜上的多肽条带。 （1 1）一般检查）一般检查如酸度、水份、无机盐、溶液颜色和澄如酸度、水份、无机盐、溶液颜色和澄清度、无菌、热原、致敏、异常毒性等。清度、无菌、热原、致敏、异常毒性等。（二）干扰素（二）干扰素的杂质检查的杂质检查（2 2）特殊杂质检查）特殊杂质检查蛋白质类药物中所含一些相关蛋白质杂蛋白质类药物中所含一些相关蛋白质杂质一般采

11、用质一般采用SDS-聚丙烯酰胺电泳法、液聚丙烯酰胺电泳法、液相色谱法、毛细管电泳法、相色谱法、毛细管电泳法、HPLC法等法等方法。方法。 （二）干扰素（二）干扰素的杂质检查的杂质检查对于基因工程类药物对于基因工程类药物（如重组人（如重组人-IFN ）的检查方法主要测定以下主要内容：的检查方法主要测定以下主要内容：分分子量、肽图、等电点、紫外吸收、纯度、子量、肽图、等电点、紫外吸收、纯度、N-末端氨基酸序列、末端氨基酸序列、外源外源DNA、残余、残余IgG等等。 （二）干扰素（二）干扰素的杂质检查的杂质检查1.1. 相对相对分子量：分子量：SDS-PAGE法法电泳完毕后，以标准蛋白质分子质量的对

12、电泳完毕后，以标准蛋白质分子质量的对数和其相对迁移率作图，得到标准曲线，数和其相对迁移率作图，得到标准曲线，根据所测样品的相对迁移率，从标准曲线根据所测样品的相对迁移率，从标准曲线上便可查出其分子质量。上便可查出其分子质量。 （二）干扰素（二）干扰素的杂质检查的杂质检查1.1.相对相对分子量：分子量：SDS-PAGE法法注意事项：注意事项：1)如果蛋白质如果蛋白质-SDS复合物不能达到复合物不能达到1.4g/1g蛋白质的比率；蛋白质的比率；2)不同凝胶浓度适用于不同的分子量范围；不同凝胶浓度适用于不同的分子量范围；（二）干扰素（二）干扰素的杂质检查的杂质检查1.1.相对相对分子量：分子量：SD

13、S-PAGE法法注意事项：注意事项： 3)测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整分子的分子量；量，而不是完整分子的分子量；4)不是所以的蛋白质都能用此法测定分子不是所以的蛋白质都能用此法测定分子量。量。 （二）干扰素（二）干扰素的杂质检查的杂质检查SDS-PAGE的原理：的原理：SDS是一种去污剂，可使蛋白质变性并解是一种去污剂，可使蛋白质变性并解离成亚基。当蛋白质样品中加入离成亚基。当蛋白质样品中加入SDS后，后，SDS与蛋白质分子结合，使蛋白质分子带与蛋白质分子结合，使蛋白质分子带上大量的强负电荷，并且使蛋白质分子的上大量的强负电荷，并且使蛋

14、白质分子的形状都变成短棒状，从而消除了蛋白质分形状都变成短棒状，从而消除了蛋白质分子之间原有的带电荷量和分子形状的差异。子之间原有的带电荷量和分子形状的差异。 SDS-PAGE法：法：因电泳的速度只取决于蛋白质分子量的大因电泳的速度只取决于蛋白质分子量的大小，且蛋白质分子在电泳中的相对迁移率小，且蛋白质分子在电泳中的相对迁移率和分子质量的对数成直线关系。和分子质量的对数成直线关系。lgMr = K bmlgMr = K bm SDS-PAGE1.1. 相对相对分子量：分子量：测定方法：测定方法：SDS-PAGE法法（二）干扰素（二）干扰素的杂质检查的杂质检查1.1. 相对相对分子量：分子量：其

15、他方法：其他方法：1)沉降法（超速离心法）沉降法（超速离心法） 2)凝胶过滤法凝胶过滤法 3)毛细管电泳法毛细管电泳法 （二）干扰素（二）干扰素的杂质检查的杂质检查2. 2. 肽图检查肽图检查：胰蛋白酶解：胰蛋白酶解+RP-HPLC肽图分析可作为与天然产品或参考品的蛋肽图分析可作为与天然产品或参考品的蛋白质一级结构做精密比较的手段。与氨基白质一级结构做精密比较的手段。与氨基酸组成和序列分析合并研究，可作为蛋白酸组成和序列分析合并研究，可作为蛋白质一级结构的精确鉴别。质一级结构的精确鉴别。 （二）干扰素（二）干扰素的杂质检查的杂质检查3. 3. 等电点测定等电点测定：等点聚焦电泳：等点聚焦电泳在

16、两性电解质存在下在两性电解质存在下,电泳胶形成一个电泳胶形成一个pH梯度梯度,蛋白质根据其等电点不同进行分离蛋白质根据其等电点不同进行分离,泳移至等电点泳移至等电点pH位置上时净电荷为零而停位置上时净电荷为零而停止泳动止泳动,形成区带形成区带,用银染或考马斯亮蓝进用银染或考马斯亮蓝进行染色。行染色。 （二）干扰素（二）干扰素的杂质检查的杂质检查3.3.等电点的测定等电点的测定( (等电聚焦电泳等电聚焦电泳) ) 4. 4. 紫外吸收紫外吸收：紫外光普扫描：紫外光普扫描对于某种蛋白质或多肽来说，它的最大吸对于某种蛋白质或多肽来说，它的最大吸收波长是固定的。紫外吸收光谱是检查蛋收波长是固定的。紫外

17、吸收光谱是检查蛋白质的一个重要的指标。白质的一个重要的指标。 （二）干扰素（二）干扰素的杂质检查的杂质检查5. 5. 纯度纯度：SDS-PAGE和和HPLC蛋白质的纯度一般是指是否含有其它杂蛋蛋白质的纯度一般是指是否含有其它杂蛋白，而不包括盐、缓冲液离子、白，而不包括盐、缓冲液离子、SDS等小等小分子在内。分子在内。（二）干扰素（二）干扰素的杂质检查的杂质检查5. 5. 纯度纯度：SDS-PAGE和和HPLC按世界卫生组织规定必须用按世界卫生组织规定必须用HPLC和非还和非还原原SDS-PAGE两种方法测定，其纯度都应两种方法测定，其纯度都应达到达到95以上才能合格。以上才能合格。 （二）干扰

18、素（二）干扰素的杂质检查的杂质检查6. 6. N端氨基酸序列分析端氨基酸序列分析 ：Edman法法 N端氨基酸序列作为重组蛋白质和肽的重端氨基酸序列作为重组蛋白质和肽的重要鉴别指标，一般至少测定要鉴别指标，一般至少测定15个氨基酸，个氨基酸，可以很大程度上排除蛋白质混淆的可能，可以很大程度上排除蛋白质混淆的可能，因为两种不同蛋白质因为两种不同蛋白质N端端15个氨基酸序列个氨基酸序列完全一致的可能性是很小的。完全一致的可能性是很小的。（二）干扰素（二）干扰素的杂质检查的杂质检查方法：方法：根据干扰素可保护人羊膜细胞根据干扰素可保护人羊膜细胞（WISH）免受水泡性口炎病毒（）免受水泡性口炎病毒（V

19、SV）破）破坏的作用，用结晶紫对存活的坏的作用，用结晶紫对存活的WISH细胞染细胞染色，于波长色，于波长570nm处测定其吸光度，可得到处测定其吸光度，可得到干扰素对干扰素对WISH细胞的保护效应曲线，以此细胞的保护效应曲线，以此测定干扰素的效价。测定干扰素的效价。 （三）干扰素（三）干扰素的效价测定的效价测定1. 溶液配制溶液配制1）RPMI1640培养液培养液2）完全培养液：量取新生牛血清）完全培养液：量取新生牛血清10ml，加，加RPMI1640培养液培养液90ml，4保存。保存。3）测定培养液：量取新生牛血清）测定培养液：量取新生牛血清7ml，加，加RPMI1640培养液培养液93ml

20、，4保存。保存。（三）干扰素（三）干扰素的效价测定的效价测定1.溶液配制溶液配制4）攻毒培养液：量取新生牛血清）攻毒培养液：量取新生牛血清3ml，加，加RPMI1640培养液培养液97ml，4保存。保存。5）标准品溶液：人干扰素国家标准品用测）标准品溶液：人干扰素国家标准品用测定培养液稀释至定培养液稀释至1000IU/ml。在。在96孔培孔培养板中作养板中作4倍稀释，共倍稀释，共8个稀释度。个稀释度。6）供试品溶液：同标准品溶液处理）供试品溶液：同标准品溶液处理（三）干扰素（三）干扰素的效价测定的效价测定2. 测定法：测定法： 完全培养液培养完全培养液培养WISH细胞，洗涤、消化后细胞，洗涤、

21、消化后配制成配制成2.51053.5105的细胞悬液，按的细胞悬液，按每孔每孔100L接种于接种于96孔板，孔板，37，5%CO2条件下培养条件下培养46h，将用攻毒培养液稀释的，将用攻毒培养液稀释的VSV（100CCID50）按每孔）按每孔100L接种，接种，37，5%CO2条件下培养条件下培养24h。（三）干扰素（三）干扰素的效价测定的效价测定2. 测定法：测定法： 每孔加入染色液每孔加入染色液50L，室温放置，室温放置30分钟后分钟后洗去染色液，吸干水分，每孔加入脱色液洗去染色液，吸干水分，每孔加入脱色液100L，室温放置，室温放置35分钟，混匀后，以分钟，混匀后，以630nm为参比波长

22、，于为参比波长，于570nm处用酶标仪测处用酶标仪测定吸光度。定吸光度。 （三）干扰素（三）干扰素的效价测定的效价测定3. 结果计算：结果计算：试验数据采用四参数方程为基础编制的计算试验数据采用四参数方程为基础编制的计算机程序自动计算出结果，也可以用稀释度的机程序自动计算出结果，也可以用稀释度的对数和相应的吸光度作直线回归，或者用半对数和相应的吸光度作直线回归，或者用半对数坐标作图法进行处理。对数坐标作图法进行处理。 （三）干扰素（三）干扰素的效价测定的效价测定3. 结果计算：结果计算：求出标准品半效量的稀释倍数和供试品相当求出标准品半效量的稀释倍数和供试品相当于标准品半效量的稀释倍数，按下式

23、计算：于标准品半效量的稀释倍数，按下式计算：待测样品效价待测样品效价= =标准品效价标准品效价待测样品预稀待测样品预稀释倍数释倍数待测样品半效稀释倍数待测样品半效稀释倍数/ /（标准品（标准品预稀释倍数预稀释倍数标准品半效稀释倍数）标准品半效稀释倍数）（三）干扰素（三）干扰素的效价测定的效价测定知识拓展知识拓展蛋白质类药物的效价测定蛋白质类药物的效价测定 （1 1）蛋白质类激素的效价测定法）蛋白质类激素的效价测定法 （2 2）免疫血清及毒素的效价测定法）免疫血清及毒素的效价测定法 （3 3）人免疫球蛋白及凝血因子的效价测定法）人免疫球蛋白及凝血因子的效价测定法 （4 4）细胞因子的效价测定法）

24、细胞因子的效价测定法 （5 5）其他：）其他：蛋白质类酶的效价测定法蛋白质类酶的效价测定法；蛋白；蛋白质类抗生素的效价测定法等质类抗生素的效价测定法等 知识拓展知识拓展蛋白质类药物的含量测定蛋白质类药物的含量测定 （1 1）凯氏定氮法）凯氏定氮法知识拓展知识拓展蛋白质类药物的含量测定蛋白质类药物的含量测定 （2 2）双缩脲法）双缩脲法（3 3）福林）福林- -酚法（酚法（Lowry法）法） （4 4）考马斯亮）考马斯亮蓝蓝G-250染染色法（色法（Bradford法）法） （5 5）紫外吸收法）紫外吸收法（6 6）其他：酶联免疫）其他：酶联免疫法（法（ELISA）、）、HPLC法、点膜结合法等法、点膜结合法等 知识拓展知识拓展氨基酸序列分析氨基酸序列分析 蛋白质多肽链的氨基酸顺序分析，即蛋白质蛋白质多肽链的氨基酸顺序分析，即蛋白质一级结构的测定，主要包括以下几个步骤：一级结构的测定，主要包括以下几个步骤：1. 1. 分离纯化蛋白质，得到一定量的蛋白质纯分离纯化蛋白质，得到一定量的蛋白质纯品（品（97%97%）。）。2. 2. 取一定量的样品进行完