基因工程(研究生)

1、 提高产量 优质 抗病虫害 抗寒、旱、涝、盐碱 抗除草剂 控制成熟抗凝血酶抗凝血酶克隆猪，器官移植克隆猪，器官移植 克隆猴，研究疾病的模型远不仅如此远不仅如此 胚胎干细胞遇到伦胚胎干细胞遇到伦理其它问题时理其它问题时 iPS出现了从受精卵开始就是生命 这个就没有问题了吗？KLF4、c-MYC、SOX2、OCT4Glis1c-MYC改造环境 拯救濒危动物 恐龙最好也能复活了！基因工程（genetic engineering ） 将外源性遗传物质外源性遗传物质 通过载体载体 转入宿主细胞内转入宿主细胞内， 经筛选筛选，使其获得新的性状的过程。基本原理（过程）基本原理（过程） 分：目的基因的获取分：

2、目的基因的获取 切：载体和目的基因的酶切切：载体和目的基因的酶切 接：目的基因和载体的连接，重组子接：目的基因和载体的连接，重组子 转：重组子转入宿主细胞转：重组子转入宿主细胞 筛：含有目的基因的重组子的宿主细胞的筛选筛：含有目的基因的重组子的宿主细胞的筛选 表达：目的基因在宿主细胞内的表达表达：目的基因在宿主细胞内的表达主主 要要 内内 容容 基因工程的发展史简介基因工程的发展史简介 基因工程的基本原理基因工程的基本原理 基因工程的应用基因工程的应用 基因工程发展简史基因工程发展简史1865年年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验的豌豆杂交试验1822-1884 基因工程发展简史基因工程发展

3、简史1944年年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验的肺炎球菌转化实验1877-1955 基因工程发展简史基因工程发展简史1970年，从流感嗜血杆菌中分离到一种限制性酶年，从流感嗜血杆菌中分离到一种限制性酶 Hamilton O. Smith美國霍普金斯大學醫學院1931年- Daniel Nathans美國霍普金斯大學醫學院1928年-1999年Werner Arber 瑞士Biozentrum大學1929年- 1978年诺贝尔奖Smith HO, Wilcox KW. A restriction enzyme from Hemophilus influenzae. I. Purifica

4、tion and general properties. J Mol Biol. 1970;51(2):379-91 第一个重组体的构建第一个重组体的构建 1972年，美国斯坦福大学年，美国斯坦福大学P.Berg等在等在PNAS上发上发表了题为表了题为 “Biochemical methode for inserting new genetic information into DNA of Simian Virus 40:circular SV40 DNA molecules cotaining lamda phage genes and the galactose operon of Es

5、cherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2904-2909, 1972”，标标志着基因工程技术的诞生志着基因工程技术的诞生。第第一一个个重重组组体体构构建建 体外不同来源重组子体外不同来源重组子1973年，年，S.N.Cohen等在美国等在美国PNAS上发表了题上发表了题为为“Construction of Biologically Functional Bacterial Plasmid In Vitro” （S. N. Cohen, A. C. Y. Chang, H. W. Boyer, and R. B. Helling, Proc.

6、 Natl. Acad. Sci. USA 70:3240-3244, 1973） 的论文，宣布体外构建的细菌质粒能够的论文，宣布体外构建的细菌质粒能够在细胞中进行表达在细胞中进行表达,从而完善了从而完善了Berg开创的基因开创的基因重组技术重组技术。Boyer and Cohen 基因工程发展简史基因工程发展简史1976年年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司工程公司BoyerSwanson 基因工程发展简史1980年年 开始建造第一家应用重组开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂技术生产胰岛素的工厂 insulin

7、From Genetech 基因工程发展简史基因工程发展简史1996年年 英国罗林研究所英国罗林研究所成功的克隆了多莉成功的克隆了多莉基因工程的流程基因工程的流程( (原理原理) ) 1 1、确定研究的目标、确定研究的目标 2 2、选择、构建合适的载体、选择、构建合适的载体 3 3、分离目的基因、分离目的基因 4 4、目的基因和载体的重组、目的基因和载体的重组 5 5、重组子转入宿主细胞、重组子转入宿主细胞 6 6、重组子的筛选、重组子的筛选 7 7、目的基因表达、目的基因表达1. 1. 确定研究的目标确定研究的目标 纯的蛋白质 不需纯化蛋白功能研究功能研究 真核表达 酵母、昆虫、动物细胞 原

8、核表达 大片段DNA克隆 150kb以上克隆研究克隆研究 原核 真核是否要稳定表达是否要稳定表达2. 选择、构建合适的载体选择、构建合适的载体 研究目的决定研究目的决定 载体选择后，对基因克隆方法具有一定的载体选择后，对基因克隆方法具有一定的指导作用。指导作用。 为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。分子。2. 2. 选择、构建合适的载体选择、构建合适的载体（1 1）载体的分类）载体的分类 根据宿主的对象根据宿主的对象 根据载体的性质根据载体的性质 原核原核 真核真核 质粒质粒 病毒病毒 根据功能

9、根据功能 克隆克隆 表达表达2. 2. 选择、构建合适的载体选择、构建合适的载体 独立于染色体外的能够进行独立于染色体外的能够进行自我复制自我复制的的共价共价、闭环闭环、双链双链的的DNADNA分子分子（2 2）质粒（）质粒（plasmidplasmid） 严紧型质粒严紧型质粒 复制时需复制时需DNADNA聚合酶聚合酶I I 1-5 1-5个个copiescopies 松弛型质粒松弛型质粒 复制时需复制时需DNADNA聚合酶聚合酶IIIIII 10-200 10-200个个copiescopies以上以上质粒的基本条件质粒的基本条件 分子量要小分子量要小 复制起始点复制起始点 多个克隆位点多个

10、克隆位点 筛选标志筛选标志 容量要大容量要大 15K15K左右左右原核表达载体原核表达载体-Pharmacia-Pharmacia Tac Promoter GST-融合蛋白 GST标签原核表达载体原核表达载体-Promega-Promega T7启动子控制 体外转录 SP6 T3原核表达载体原核表达载体-Merck-Merck T7启动子控制 TrxA标签 His标签TrxAHis tagHis tagenterokinase siteThrombin site原核表达载体原核表达载体选择注意事项选择注意事项 启动子启动子 T7T7，LacZ, TacLacZ, Tac等等 标签（标签（Ta

11、gTag）的选择）的选择 GSTGST TrxA TrxA His Tag His Tag SDSD序列问题序列问题 真真 核核 载载 体体 原核载体的条件原核载体的条件 仍需其它条件仍需其它条件 真核细胞复制起始点真核细胞复制起始点 polyApolyA位点位点 真核的抗性真核的抗性真真 核核 载载 体体-invitrogen-invitrogen真真 核核 载载 体体-clontech-clontech真真 核核 载载 体体-选择注意事项选择注意事项 启动子启动子 SV40，CMV，等，等 Koza序列序列 -3，+4法则法则,GCCACCATGG 有无真核筛选标志有无真核筛选标志 Neo

12、(G418)、Hyr(潮霉素潮霉素) EGFP、RFP、YFP 载载 体体 构构 建建 启动子强度启动子强度 CAG启动子启动子 C：巨细胞病毒增强子，：巨细胞病毒增强子， A：鸡：鸡 -actin启动子，启动子， 鸡鸡 actin外显子外显子1， 鸡鸡 -actin内含子内含子1， G：兔：兔globin内含子内含子2， 兔兔globin外显子外显子3pGL3-EnII-PcoreEnII PcorepGL3-CMVpGL3-AATpGL3-ForAATpGL3-RevAATpGL3-ControlSV40 enhancerSV40 promoterLuciferase载载 体体 构构 建建

13、 组织表达特异性组织表达特异性 特异性启动子特异性启动子293H2pG202040100120140160180Relative Luciferase Activity(CMV%) EnIIPcore AAT ForAAT RevAAT CMV SV402930.00.20.40.60.8100120140160载载 体体 构构 建建 表达可控性表达可控性 加入药物后、或停药后表达加入药物后、或停药后表达四环素控制系统VP16 transaction domain of herpes simplex virusTet off :去除四环素后表达Tet on :加入四环素后表达载载 体体 构构

14、建建 表达可控性 加入药物后表达RU486系统载 体 构 建 表达可控性表达可控性 加入药物后表达加入药物后表达RU486系统（1994）加入后表达元件组成：Gal4DBD：酵母转录因子Gal4的DNA结合区VP16AD：单纯疱疹病毒蛋白VP16激活区PRLBD-891： PR-891突变体改良后的C末端配体结合区VP16AD,目前用目前用NF- B的的p65激活区代替激活区代替用来减少免疫原性用来减少免疫原性载载 体体 构构 建建 表达可控性表达可控性 加入药物后不表达加入药物后不表达载载 体体 构构 建建 一条mRNA分子双基因表达IRESInternalRibosomeEntrance

15、Site载载 体体 构构 建建 Clontech pIRES2特定位点切除载体特定位点切除载体锌指核酸酶噬菌体噬菌体DNA改造系统改造系统 gt系列（插入型，适用系列（插入型，适用cDNA克隆）克隆）（3 3）噬菌体）噬菌体(phage) (phage) 噬菌体噬菌体DNA改造系统改造系统 EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）系列（置换型，适用基因组克隆）（3） 噬菌体噬菌体(phage) M13噬菌体噬菌体DNA改造系统（含改造系统（含lacZ基因）基因）M13mp系列系列pUC系列系列（3 3） 噬菌体噬菌体(phage) (phage) Phage display technology

16、Phage display technology（4）. 粘性质粒粘性质粒(cosmid)可插入可插入45kb（5）酵母人工染色体）酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC)200kb左右（6）细菌人工染色体）细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC)F1质粒改建而来可容纳50kb以上的DNA（7）动物病毒）动物病毒DNA改造的载体改造的载体 腺病毒腺病毒动物病毒动物病毒DNA改造的载体改造的载体 腺病毒腺病毒顺时表达，不整合，可以感染非分裂细胞顺时表达，不整合，可以感染非分裂细胞（8）动物病毒）动物病

17、毒DNA改造的载体改造的载体慢病毒慢病毒(HIV)-逆转录病毒逆转录病毒(MMLV)慢病毒：可稳定整合，宿主范围广，可感染分裂细胞慢病毒：可稳定整合，宿主范围广，可感染分裂细胞逆转录病毒：可稳定整合，宿主范围有限，感染分裂细胞逆转录病毒：可稳定整合，宿主范围有限，感染分裂细胞植物载体植物载体植植 物物 载载 体体具有五个主要功能区域：. T-DNA：LB与RB间T-DNA序列整合到植物基因组；. 质粒转移区(PT)；. 冠瘿碱(opine)代谢区；. 复制原点；. 毒性区。3 3、目的基因获取、目的基因获取获取目的基因的方法获取目的基因的方法（1 1）从基因文库中获取）从基因文库中获取（2 2

18、）利用）利用PCRPCR技术扩增技术扩增（3 3）人工合成）人工合成1 1、从文库中筛选、从文库中筛选需用探针需用探针（2 2）利用）利用PCRPCR技术扩增技术扩增若序列已经明确利用模板、PCR扩增引物5端进行修饰，加入酶切位点，与载体对应酶1切酶2切最常用的方法最常用的方法还可做其它修饰，还可做其它修饰，如加入如加入attB位点位点3 3）根据已知的氨基酸序列合成）根据已知的氨基酸序列合成DNADNA法法 ：蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测推测推测目的基因目的基因化学合成化学合成3 3）根据已知的氨

19、基酸序列合成）根据已知的氨基酸序列合成DNADNA法法 ：合成长度有限，120bp单链，需多次，需拼接可以合成需多次突变产生可以在密码子偏好性差的细胞中表达的基因4 4、目的基因与载体的连接、目的基因与载体的连接 连接的方法连接的方法 生成磷酸二酯键的酶生成磷酸二酯键的酶 DNADNA连接酶连接酶 重组酶重组酶 拓扑异构酶拓扑异构酶4 4、目的基因与载体的连接、目的基因与载体的连接 连接的方法连接的方法（1 1）采用连接酶的方法）采用连接酶的方法（2 2）利用重组酶的方法）利用重组酶的方法（3 3）利用拓扑异构酶的方法）利用拓扑异构酶的方法4 4、目的基因与载体的连接、目的基因与载体的连接（1

20、）采用连接酶的方法DNA连接酶T4DNA连接酶Ecoli DNA连接酶 辅基NAD Ecoli DNA连接酶常用于双链DNA合成4 4、目的基因与载体的连接、目的基因与载体的连接（2 2）利用重组酶的方法）利用重组酶的方法( (噬菌体整合机制噬菌体整合机制) )attB 25bp， attP 240bp4 4、目的基因与载体的连接、目的基因与载体的连接（2）利用重组酶的方法(噬菌体整合机制)4、目的基因与载体的连接、目的基因与载体的连接（3）利用拓扑异构酶的方法4、目的基因与载体的连接、目的基因与载体的连接（3）利用拓扑异构酶的方法）利用拓扑异构酶的方法T载体载体PCR产物末端加产物末端加A转

21、转 目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达5 5、重组子导入宿主细胞、重组子导入宿主细胞方法方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法脂质体转染脂质体转染磷酸钙共沉淀磷酸钙共沉淀电击电击显微注射法显微注射法纳米颗粒纳米颗粒感受态细胞感受态细胞5、重组子导入宿主细胞、重组子导入宿主细胞导入微生物细胞导入微生物细胞感受态细胞感受态细胞5 5、重组子导

22、入宿主细胞、重组子导入宿主细胞宿主细菌的选择宿主细菌的选择A. 克隆载体，DH5，topo10,XL-1等B. 表达载体，BL21（DE3）等，与载体相对启动子的RNA聚合酶的细菌宿主细菌一般是重组酶缺陷，限制性内切酶缺陷宿主细菌一般是重组酶缺陷，限制性内切酶缺陷大多来自大多来自K12的改造的改造转染方法：常用CaCl2 RbCl2(效率高)导入动物细胞导入动物细胞脂质体转染脂质体转染 lipofectamine2000lipofectamine2000、Fugene6Fugene6磷酸钙共沉淀磷酸钙共沉淀电击电击基因枪基因枪显微注射法显微注射法纳米颗粒：阳离子聚合物聚乙烯亚胺纳米颗粒：阳离子

23、聚合物聚乙烯亚胺(PEI)(PEI)5 5、重组子导入宿主细胞、重组子导入宿主细胞导入植物细胞导入植物细胞5 5、重组子导入宿主细胞、重组子导入宿主细胞6 6、重组子的筛选、重组子的筛选检查是否成功检查是否成功检测检测鉴定鉴定检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法方法方法方法方法DNADNA分子杂交，分子杂交，PCRPCR，酶切、测序，酶切、测序分

24、子杂交分子杂交抗原抗体杂交抗原抗体杂交测测 序序PCR的方法，较易出现假的方法，较易出现假阳性阳性测序是必须进行的，是序测序是必须进行的，是序列正确与否的金标准列正确与否的金标准 互补互补利用利用互补原理筛选重组体互补原理筛选重组体pUC18 原核基因表达 可溶性表达问题 表达修饰问题表达修饰问题 密码子偏性问题7 7、（、（1 1）目的基因表达）目的基因表达 包涵体形成，需变性复性包涵体形成，需变性复性 采用改变氧化还原状态的细菌采用改变氧化还原状态的细菌 糖基化修饰，二硫键形成糖基化修饰，二硫键形成 采用具有稀有密码子的细菌采用具有稀有密码子的细菌Merck公司的载体公司的载体1、与一个高度可溶的多肽联合一起表达，比如：谷胱甘肽S转移酶（glutathione S transferase, GST）、硫氧还蛋白（thioredoxin, Trx）和N利用质A（N utilization substance A, NusA）。 2、转入一个酶催化二硫键的形成，如：硫氧还蛋白，DsbA，DsbC。 3、插入一个定位到周质空间的信号序列。宿主菌