水中大肠杆菌地检测方法

1、附件水中大肠杆菌群检测方法-多管发酵法一、方法概要本方法系用以检测水中革兰氏染色阴性，不产生内生抱子之杆状好氧或兼性厌氧菌，且能在35 士 1 C48 士小时发酵乳糖并产生酸与气体之大肠杆菌群Coliform group丨；在不同体积或不同稀释度之水样所产生之结果，以 100 mL水中最大可能数MPN/100 mL表示100 mL水中存在之大肠杆菌群数目。二、适用X围本方法适用地面水体、地下水体、废水、污水与水源水质水样中大肠杆菌群之检验。三、干扰（一）水样中含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长之物质。（二）检测使用的玻璃器皿与设备含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长的物质。四、设备（一）量筒：100

2、至1000 mL之量筒。（二） 吸管：有刻度之 10 mL灭菌玻璃吸管或市售无菌塑料吸管，或无菌微量吸管micropipet。（三）试管：大小约150 x 15 mn之试管或有盖螺旋试管。（四）发酵管ferme ntation tube：大小约 22 x 9 mm之玻璃管。（五）稀释瓶：容量约 100 mL可灭菌之硼硅玻璃制品。（六）锥形瓶：200至2000 mL之可灭菌硼硅玻璃制品。（七）采样容器：容量 120 mL以上无菌之硼硅玻璃瓶或无菌塑料有盖容器，或市售无菌袋。（八）冰箱：温度能保持在 4 士 2者。（九） 天平：待测物重量大于2 g时，须能精秤至 0.01 g；待测物重量不大于2

3、g时，须能精秤至 0.001 go（十）培养箱：温度能保持在 35 士 1 者o（十-）高压灭菌釜：温度能维持在121C压力约15 lb/in2或1.1 Kg/cm2灭菌15分钟以上者。（十二）高温干热烘箱：如用于玻璃器皿等用具之灭菌，温度须能保持在 160C达2小时或170C达1小时以上者（十三）接种环：为白金或镍铬合金制，适用于细菌接种或移植，亦可使用无菌塑料制品。什四）pH计：准确度达 0.1 pH单位。五、试剂（一） 试剂水：蒸馏水或去离子水，导电度在25 C时小于2卩mho / cm卩S / cm（二）培养基，应使用市售商品化培养基。1、硫酸月桂酸胰化蛋白胨培养基Lauryl sul

4、fate tryptose broth，简称LST1倍浓度LST培养基含有如下成份:胰化蛋白胨Tryptose乳糖Lactose氯化钠NaCl磷酸氢二钾K2HPO4磷酸二氢钾KH2PO4硫酸月桂酸钠Sodium lauryl sulfate试剂水1L配成2倍浓度取71.2 g LST培养基粉末溶于 1 L试剂水，完全溶解后，分取 10 mL注入装有 倒置发酵管之试管内，经 121C灭菌15分钟，冷却后备用，灭菌后培养基之pH值应在。灭菌后培养基假如未当日使用，应保存在 4 士 2 C保存期限为14天。可根据检验需求量，依配方配制培养基。2、煌绿乳糖胆汁培养基 Brilliant green l

5、actose bile broth，简称 BGLB1公升的BGLB培养基中含有如下成份:蛋白胨Peptone 乳糖Lactose牛胆粉Oxgall Powder煌绿色试剂Brilliant Green试剂水1L取40 g BGLB培养基粉末溶于1 L试剂水，完全溶解后，分取5至10 mL注入装有倒置发酵管之试管内，经121C灭菌15分钟，冷却后备用，其pH值应在。灭菌后培养基假如未当日使用，应保存在4 ± 2 C保存期限为14天。可根据检验需求量，依配方配制培养基。（三）无菌稀释液1、磷酸二氢钾储藏溶液取3.4 g磷酸二氢钾KH2PO4溶于50 mL的试剂水中，俟完全溶解后，以1.0

6、 N NaOH溶液调节其pH值为，然后加试剂水至100 mL，灭菌过滤灭菌或 121 C高温高压灭菌15分钟后储存于冰箱中备用。4 ± 2 C下保存期限为 3个月。2、氯化镁储藏溶液取8.1 g氯化镁MgCl 2? 6H2O，先溶于少量试剂水， 俟完全溶解后，再加试剂水至全量为 100 mL， 灭菌过滤灭菌或 121C高温高压灭菌15分钟后，储存于冰箱中备用。 4 ± 2 C下保存期限为 3 个月。3、无菌稀释液分别取10 mL氯化镁储藏溶液和 2.5 mL磷酸二氢钾储藏溶液再参加试剂水至2,000 mL，混摇均匀后，分装于稀释瓶中，经121C灭菌15分钟，作为无菌稀释液备

7、用。如欲用于水样稀释，分装之无菌稀释液灭菌后体积须为90 士 2.0 mL。4 ± 2 C下保存期限为 3个月。六、采样与保存（一） 盛装水样检验微生物之容器，应使用清洁并经灭菌之玻璃瓶或无菌塑料容器或市售无菌采样袋，且于采样时应防止受到污染。水样假如含有余氯时，无菌容器中应参加适量之无菌硫代硫酸钠采取加氯之废水 时，每100 mL水样中参加0.1 mL、10%硫代硫酸钠可复原 15 mg/L余氯。采取含氯之饮用水水样时，每 100 mL之水样如参加 0.1 mL之3%硫代硫酸钠，可中和之余氯量约为5 mg / L。（二）采样前应清洁手部，再行采水样，所采水样应具有代表性。（三） 运

8、送时水样温度应维持在小于10 C且不得冻结，而实验室内保存温度应维持在4 士 2 Co（四） 水样应于采样后 24小时内完成推定实验之水样添加步骤七、步骤（一） 4、，并置入培养箱中培养。（五）水样量须以能做完所需检验为度，但不得少于120 mLo七、步骤试验分两阶段进展。首先进展推定试验，假如推定试验结果为阳性反响，如此继续进展第二阶段之确定试验，如结果仍是阳性反响如此显示有大肠杆菌群存在。各试验步骤如下述：（一）推定试验1、慎选发酵管中没有气泡且未污染之 10 mL、2倍浓度LST试管。2、水样在进展检测或稀释之前必须剧烈摇晃25次以上，以使样品充分混摇均匀。3、视水样中微生物可能浓度X围

9、进展水样稀释步骤，使用无菌吸管吸取10 mL水样至90 mL无菌稀释液中，形成10倍稀释度水样，混合均匀，而后自10倍稀释度水样以一样操作方式进展一系列适当之100、1000、10000倍等稀释水样， 进展稀释步骤时，均需更换无菌稀释吸管， 水样稀释步骤如图一所示 注 1。4、以无菌吸管分别取各稀释度10 mL水样至内含10 mL 2倍浓度的LST试管中，每一稀释度各作5支，小心混合均匀，混合后发酵管内不可产生气泡。5、在35 士 1培养箱中培养 48 士 3、时，观察并记录发酵情形，假如有气体产生如此推定试验为阳性反响，假如无气体产生如此推定试验为阴性反响，但假如培养液呈混浊状态，虽无产气，

10、亦应进展确定 试验。（二）确定试验假如推定试验之发酵管中有气体或混浊产生时，如此使用BGLB进展确定试验：1、慎选发酵管中没有气泡且未污染之BGLB试管。2、利用无菌接种环自产生气体以与混浊之LST培养基试管中，接种一圈培养液至BGLB培养基试管中。3、在35 士 1培养箱中培养 48 士 3小寸。4、在48 士 3、时内，BGLB培养基试管如有气体产生，如此确定试验为阳性反响。八、结果处理（一） 经确定试验确认 BGLB试管为阳性反响后，应以 100 mL水中最大可能数MPN/100 mL丨计算与记录。5支发酵管连续三种稀释度之MPN可查表一。（二） 表一所示接种之水样量为10 mL、1.0

11、 mL与0.1 mL，假如所用之稀释度有三种以上时，采用最具意义之三种稀释度，查表后再计算100 mL水中大肠杆菌群最大可能数。稀释度之选取方式如下：4 / 81、先选取5管均呈阳性反响的最高稀释度此时稀释度较低之各组试管必须全部呈阳性反响，再选取下两个稀释度如表二水样别a。2、如果稀释度最低的一组并非 5管均呈阳性反响，如此选取稀释度最低的一组， 再选取下两个稀释度 如表二水样别b、c。3、如果依据上述原如此1、与2、选取3个稀释度后，下一稀释度试管组仍有阳性反响试管，如此舍弃原先3组中稀释度最低的一组，纳入下一稀释度的数据如表二水样别d。4、如果依据上述原如此1、至3、选取3个稀释度后，更

12、高稀释度之试管组仍有阳性反响试管，如此把更高稀释度之阳性反响试管数加至原先3组中稀释度最高的一组如表二水样别e。（三）100 mL水中大肠杆菌群最大可能数MPN/100 mL丨之计算公式如下:大腸桿菌群最大可能8fc（MPN/l 00 mL）=查表所得之MPN値TO最具意義三種稀釋度之最九水樣騁積结果小于100时，以整数表示小数字数四舍五入，菌落数大于100以上时，只取两位有效数字:例如110以1.1 X 1表示，16,000以1.6 X 4表示。（四）检测纪录须注明采样时间、培养起始与终了时间、培养基名称、培养温度与各稀释度的数据等相关数据。九、质量管理（一）微生物采样人员与检测人员应具备微

13、生物根本训练与知识。（二）每批次采样时应进展运送空白。（三）每批次或每10个水样需进展试剂空白实验。（四） 新购入之培养基，每批号均须以大肠杆菌群阳性控制菌株如E. coli、Enterobacter aerogenesCitrobacter freundii进展测试，以确保数据质量。（五）假如一季期间水样均未检岀大肠杆菌群，如此须以大肠杆菌群菌株进展培养基测试，以确保数据质量。（六）本方法培养所得之细菌可能具有感染性，检测后之培养基与器皿应经高温高压灭菌处理。十、精细度与准确度略I、参考数据（一 ）APHA. 2005. Sta ndard Methods for the Exami nat

14、ion of Water and Wastewater, 21st Editio n. Section 9221.American Public Health Association. Washington, D.C.（二）Difco & BBL Manual: Manual of Microbiological Culture Media. 2003. BD Diagnostic Systems.注1 :水样如须稀释，建议于稀释后30分钟内完成检测步骤，以免造成细菌死亡或增生，影响实验结果10mL10mL10信稀釋水樣10mLi oo倍稀層水e10mL10曲倍删水樣loooloooo

15、«r分別取lDmL 10 倍稀釋水様至5 支 ILr培養基之試管分牙瞰10mL 100倍 稀釋水棣至$支2倍 濃度L3T培養基之試 管分另【瞰10mL 1000 倍棘水様至5支 2倍濃度LST培養 墓之試管分另瞰10mL 10000 倍郦曜水桂至5支2 倍濃度LST培養基图一水样稀释步骤三连续稀释度10 mL、1 mL、0.1 mL丨五试管重复测试时，阳性结果组合之MPN指数与95%信赖区间阳性反响组合MPN/100 mL95%信赖区间阳性反响组合MPN/100 mL95%信赖区间下限上限下限上限0-0-0<1.86.84-0-3259.8700-0-11.80.0906.84

16、-1-0176.0400-1-01.80.0906.94-1-1216.8420-1-13.60.70104-1-2269.8700-2-03.70.70104-1-33110700-2-15.51.8154-2-0226.8500-3-05.61.8154-2-1269.8701-0-02.00.10104-2-23210701-0-14.00.70104-2-338141001-0-26.01.8154-3-0279.9701-1-04.00.71124-3-13310701-1-16.11.8154-3-239141001-1-28.13.4224-4-034141001-2-06.11

17、.8154-4-140141001-2-18.23.4224-4-247151201-3-08.33.4224-5-041141001-3-1103.5224-5-148151201-4-0103.5225-0-0236.8702-0-04.50.79155-0-13110702-0-16.81.8155-0-243141002-0-29.13.4225-0-358221502-1-06.81.8175-1-033101002-1-19.23.4225-1-146141202-1-2124.1265-1-263221502-2-09.33.4225-1-384342202-2-1124.126

18、5-2-049151502-2-2145.9365-2-170221702-3-0124.1265-2-294342302-3-1145.9365-2-3120362502-4-0155.9365-2-4150584003-0-07.82.1225-3-079222203-0-1113.5235-3-1110342503-0-2135.6355-3-2140524003-1-0113.5265-3-3170704003-1-1145.6365-3-4210704003-1-2176.0365-4-0130364003-2-0145.7365-4-1170584003-2-1176.8405-4-2220704403-2-2206.8405-4-32801007103-3-0176.8405-4-43501007103-3-1216.8405-4-543015011003-3-2249.8705-5-0240707103-4-0216.8405-5-