芥菜开花调控蛋白AGL24与SOC1基因相互作用的分子机制

1、芥菜开花调控蛋白 AGL24 与 SOC1 基因相互作用的分子机制芥菜是我国南方广泛栽植的十字花科蔬菜作物 , 开花时间的早晚将会影响产 品器 官的产量与品质。 虽然在模式植物拟南芥中已别离出大量与开花相关的基因 , 但是, 在 蔬菜作物芥菜上这些同源基因是否具有相似的功能,它们调控芥菜开花 时间的分子机制究竟如何 , 目前并不清楚。迄今为止 ,有关芥菜 AGL24 蛋白与 SOC1 基因之间的作用机制仍未见报道。为 了 研究芥菜 AGL24 蛋白与 SOC 基因的互作机理 , 本试验通过酵母单杂交体系和双 萤光素 酶活性检测系统检测了芥菜 SOC1 启动子的全长、截短体 含 CArG-box

2、 基 序的 3 个 SOC1 小片段 、突变体 CArG-box 基序突变后的小片段 分别与 AGL24 蛋白之间 的相互作用 ,从而筛选 SOC1 启动子与 AGL24 蛋白的结合区域。此外还利用农杆菌介导 AGL24 转化芥菜 ,从体内验证转基因植株对 SOC 基因 表达 及开花的影响。为深入研究 SOC 僮因的表达调控提供一定的理论根底。主要试验结果如下 :1.芥菜 AGL24 基因的克隆及生物信息学分析以芥菜茎尖 总 RNA 反转录 cDNA 第一链作为模板 , 扩增得到的 AGL24 基因的 cDNA 序列为 666 bp, 预测编码 221 个氨基酸残基。通过 Prot Param

3、 软件分析说明 AGL24 蛋白由 20 种氨基 酸组成,其中Leu和Ser所占比例最高,相对分子质量为24.902 kDa,理论 等电点为7.672. 芥菜 SOC1 启动子全长与 AGL24 蛋白相互作用检测筛选抑制重组酵母菌Y1H pAbAi-SOC1生长的环酯肽抗生素Aureobasidin A,简称AbA的最低浓度,结 果说明当 AbA 浓度为 100 ng/m L 时， 酵母重组菌株 Y1HpAbAi-SOC1 不能生长 , 由 此说明抑制重组酵母菌株 Y1H pAbAi-SOC1 的 AbA 最低浓度为 100 ng/m L 。然 后 将构建好的酵母表达载体 pGADT7-AGL

4、2 转化到 Y1HpAbAi-SOC1 酵母感受态细胞中 , 发现二倍体酵母 Y1HS0C1+AGL2 能在 sd/-leu/aba100 上正常生长 , 表 明芥菜 soc1 启动子能与 agl24 蛋白相互作用。同时 , 构建双萤光素酶表达载体 luc-soc1 和 sk-agl24, 通过冷热刺激法转化 到农 杆菌 gv3101(psoup) 中。然后将这两种菌液按 1:9 的比例混合共侵染 6 片左 右真叶 的本氏烟 ,60h 后在 glomax?-multi+ 多功能检测仪上检测萤火虫萤光素酶 活性和海肾 萤光素酶的活性 , 并计算萤火虫萤光素酶与海肾萤光素酶的比值。结果说明，试验组

5、的比值显著高于阴性对照组的，说明socl启动子与agl24蛋白在 植物细胞内可以互作。 3.芥菜 socl 启动子的截短体与 agl24 蛋白相互作 用检测为了进 一步找出 agl24 蛋白与 soc1 启动子结合的关键区域 , 本试验筛选出 抑制重组酵母菌 株 y1h(pabai-soc1-1) 、 y1h(pabai-soc1-2) 和 y1h(pabai-soc1-3) 生长的 aba 最低浓 度分别为 100ng/ml 、150ng/ml 和 100ng/ml 。然后将酵母重组质粒 pgadt7-agl24 分别转化到 y1h(pabai-soc1-1) 、 y1h(pabai-soc

6、1-2) 和 y1h(pabai-soc1-3) 酵母感受态细胞中。 结果发现 :只有二 倍体 酵母菌株 y1h(pabai-soc1-2+agl24) 能在含有相应 aba 背景浓度下的培养基 sd/-leu/aba150 上正常生长 , 而其他的均不能生长。为了进一步鉴定芥菜 soc1 启动子截短体与 agl24 在植物体内的互作情况 , 本试 验分别将 soc1 启动子的三个截短体与双萤光素酶表达载体 pgreenii0800-luc 连接 , 得到重组质粒 luc-soc1-1 、 luc-soc1-2 和 luc-soc1-3, 通过冷 热刺激法分别转化农杆菌感受态 gv3101(p

7、soup) 。然后分别将转有启动子 片段的农杆 菌菌液和转有 agl24 蛋白的农杆菌菌液按 od600 比值 1:9 混合均匀。再将混匀的菌液分别侵染 6片真叶的本氏烟，60h后在glomax?-multi+多功能检 测仪上检测萤火虫萤光素酶活性和海肾萤光素酶的活性 , 并计算萤火虫萤光 素酶与海 肾萤光素酶的比值。结果说明 : 所有试验组的比值均显著高于阴性对照 组的比值。说明三个截短体 socl-1 、S0C1-2 和 S0C1-3 均能与 agl24 蛋白在植物细胞内 相互作用。 4. 芥菜 soc1 的启动子 carg-box 突变体与 agl24 相互作用检测为了更 进一步 分析

8、agl24 蛋白是否特异性的结合到 soc1 启动子截短体上的 carg-box 基序 , 本试验提 取实验室已构建好的两种 soc1 启动子突变体片段 (carg-box 内 a-t 碱基互换突变及 carg-box 删除突变体 )与酵母表达载体连接的重组质粒 , 然 后将其分别转化酵母感受 态菌株 y1h 。筛选出抑制酵母菌株 ylh(pAbAi-SOCI-IE) 、Y1H(pAbAi-SOC1-2E 和Y1H(pAbAi-SOC1-3E 生长的 AbA 最低浓度分别为 100 ng/mL 、150 ng/mL 和 200ng/m L,抑制酵母菌株 YIH(pAbAi-SOCI-ID) Y

9、1H(pAbAi-SOC1-2D 禾口 Y1H(pAbAi-SOC1-3D) 生长的 AbA 最低浓度分别均为 100 ng/m L 。然后将酵母重 组质 粒 pGADT7-AGL2 分别转化到 Y1H(pAbAi-SOC1-1E) 、Y1H(pAbAi-SOC1-2E) 、 Y1H(pAbAi-SOC1-3E) 、 Y1H(pAbAi-SOC1-1D) 、 Y1H(pAbAi-SOC1-2D) 、 Y1H(pAbAi-SOC1-3D 酵母感受态细胞中。结果发现 ：所有二倍体酵母菌株均不能在含有相应AbA 背景浓度下的培养基SD/-Leu/AbA 上正常生长。为了进一步确定芥菜 SOC 启动子

10、突变体片段与 AGL24 在 植物体内的互作情况 ,本试验分别将 SOC 启动子的 6个突变体片段与双萤光素 酶表达 载体 pGreen II0800-LUC 连接, 得到重组质粒 LUC-SOC1-1 、ELUC-SOC1-2 、E LUC-SOC1-3E LUC-SOC1-1D LUC-SOC1-2D LUC-SOC1-3D并将重组质粒通过冷热刺激法分别转化重组农杆菌 GV3101(pSoup) ，按OD6O0 的比值 1:9 将启动子突变体片段与 AGL24 蛋白混合均匀。然后将混匀的菌 液 分别侵染 6片真叶的本氏烟 ，60 h 后在 GloMax?-Multi+ 多功能检测仪上检测萤 火虫萤光素酶活性和海肾萤光素酶的活性 , 并计算萤火虫萤光素酶与海肾萤光素 酶的比值结果说明 : 所有试验组的比值与阴性对照组的比值差异不显著。说明 SOC1 截短体 小片段 CArG-box 内 A 碱基与 T 碱基互换或者删除 CArG-box 后,均不能与 AGL24 蛋 白发生相互作用。以此推断 :SOC1 与 AGL24 之间的相互作用会受到 CArG-box1 、CArG-box2 和 CArG-box3 特异性调控。 5.芥菜 AGL24 转基因表