荧光蛋白基因试验

1、荧光蛋白基因实验胡建江，王安博实验一质粒DNA的提取目的及意义：1.学习碱裂解法提取质粒的原理和方法；2. 学习DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。实验原理：溶液 I 50mmol/L 葡萄糖、10mmol/L EDTA-Na 25mmol/LpH=8.0Tris-HCI 可以分散细胞，螯合金属离子可以使酶失活，防止DNA勺降解；溶液ll0.4mol/L NaOH 与2%SDS&用前1:1配用可 以使细胞在溶液中降解时，蛋白质与染色体DNA发生变性；溶液III5mol/L 醋酸钾 30ml、5mol/L 冰醋酸 5.75ml、5mol/L 双蒸水14.25ml使得酸性条件下质粒 DNA复

2、性，留在上清液，而 DNA和蛋 白质一SDS复合物等发生沉淀。实验用品：1. 仪器恒温摇床、高压灭菌锅、超净工作台、10uL+100uL+1000uL微量移液器各一支、台式高速离心机、制冰机、混合漩涡器。2. 材料事先培养好的含目的基因质粒的菌液、1.5ml塑料离心管、 EP管架、微量取液器及取液器吸头、三角瓶、量筒、试剂瓶等3. 试剂LB培养液：蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 5g、pH=7.5; 溶液I/II/III ; 50mg/ml卡那霉素贮存液 工作浓度50ug/ml; 100mg/ml氨苄青霉素贮存液 工作浓度100ug/ml ;抽提液：饱和酚：氯仿：异 戊醇+25:24:

3、1作用：氯仿可使蛋白质变性，有助于液相与有机相的 别离，饱和酚密度大，可使DNA在上清液中，异戊醇防止抽提液气泡； 无水乙醇作用：除去DNA水化层，使DNA沉淀；70沱醇作用：纯化质粒DNA含RNA酶的ddH2O作用：溶解DNA实验步骤：将目的基因质粒的大菌种接种在液体培养基中相应浓度抗生素，37摄氏度培养过夜取培养菌液1.5mL置EP管中，10000rpm, 2min，弃上清液后，此步骤重复一次，弃上清液参加100uL溶液I，漩涡器上充分混匀，在室温下放置10min参加200uL新配置的溶液II，轻轻翻转2-3次，使之混匀，冰上放置5min*参加150uL冰冷的溶液III，加盖后温和颠倒数次

4、使混匀，产生白色絮状物，冰上放置15mi nv10000rpm 5mi n,取上清液于另一干净的离心管中向上清液中参加等体积约400uL 的抽提液，振荡混匀，10000rpm10min，将上清液转移至新的离心管中参加等体积约370uL氯仿/异戊醇24:1,混匀，离心2min，取上清液于新离心管中向上清液参加其2倍体积无水乙醇，混匀，-20摄氏度放置30min12000rpm 5mi n，倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体加0.8ml70%乙醇，离心1min，倒去上清液，真空抽干或室温自然干燥 30min1 加20ul含RNA酶的ddH20，-20摄氏度保存备用考前须知：1饱和酚取下层

5、单独吸，氯仿：异戊醇24:1吸;2制备质粒过程中，所有操作必须缓和，不要剧烈震荡特别是参加溶液II和III，以防止机械剪切力对DNA的断裂作用；3在取各种试剂的过程中，一定注意移液器吸头的更换，防止污染。实验二 质粒DNA琼脂糖凝胶电泳检测实验原理：在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取的质粒可能有 三种：线性DNA开环DNA闭环超螺旋DNA当提取的质粒DNA电 泳时，同一质粒DNA泳动速度：闭环超螺旋 线状开环。但有时也会 出现相反情况，因为与琼脂糖浓度、电流强度、离子强度及核酸染料含量相关 实验用品：1. 仪器：电泳仪、电泳槽、样品槽模板梳子、有机玻璃内槽、水 平仪、取液器、微波炉、凝胶成

6、像系统。2. 材料：提取的质粒溶液、琼脂糖、锥形瓶、一次性手套、胶铲、封 口膜、剪刀、取液器吸头。3. 试剂：Gold view DNA染液、1 X TAE缓冲液、上样缓冲液6 X Loadi ng Buffer 。实验步骤：1. 琼脂糖凝胶板的制备：称取0.3g琼脂糖，置于锥形瓶中，参加30ml1 X TAE缓冲液，微波炉加热直至琼脂糖溶解。待胶液冷却至65摄氏度不烫手为宜，参加1uL Gold view 混匀，搅拌器上搅拌排除 气泡，缓慢倒入事先准备的制胶有机玻璃槽插入样品槽模板梳子 内。静置30min左右，轻轻晃动拔出梳子。2. 加样：胶板放入电泳槽中样品孔位于负极，注入1 X TAE缓

7、冲 液淹没过胶板1mm用取液器将提取的质粒 DNA 5uL与1uL Loading Buffer6X混匀，参加胶板上的样品孔内。3. 电泳：将电泳槽与电泳仪接通，调节电压为100V左右，直至缓冲液的蓝色指示剂移动到距离胶板边缘约 1-2cm处，停止电泳。4. 观察和拍照：将胶板小心取出，放入凝胶成像系统中，调节位置居 中，波长为254nm的紫外灯下，观察凝胶中DNA存在处显示出荧光条 带。实验三PCR扩增实验原理：PCF是在生物体外进行的由引物介导的酶促 DNA扩增反响,主要有变性-退火复性-延伸三个步骤。红色荧光蛋白引物；RFP- EcgR / RFFR -正向引物F ；wat 脈 tgn

8、i：7c gtf: cct cca 討疽 eo3 反向引物-Fk 5;<cc cfc gg cte can ca7 etc $g智暹色荧光蛋白引物 p灰甲zhe r 正向引物卡仁 氏曲饴f M右 亦可庐a?农ggc莎q辰向引物 f 5r-GGG 朮 徒 eftetc 戲0 cax9 p实验步骤：1.在0.2mL EP管内配制50uLPCR反响体系一个:反响物体积uLddH203410 X Buffer5MgCI234X dNTP2正向引物1反向引物1Taq酶1质粒DNA模板32.混匀后瞬时离心;3放入PCR仪中，设置反响程序：94C预变性5min;94C变性30S;55C退火30S;72

9、C延伸60S;重复步骤-30次；72 C 延伸 10min ；4. 取5uL反响液加1uL 10x loading buffer做电泳检测，分析所有目的片段的大小。实验四酶切实验实验原理：生物体内能识别并切割特异的双链 DNA序列的一种内切 核酸酶。由于这种切割作用是在 DNA分子内部进行的，故名限制性 内切酶。PCR是在生物体内进行的由引物介导的酶促 DNA扩增反响, 主要有变性-退火-延伸三个步骤，一般重复25-30次，短时间内， 使目的基因片段扩增2nn代表循环次数。Bam 切割识别序列后厂生的粘性末端;宁G0TCC刃-了G可GGTA.GTG ！T - E-tCHLG GI?Not I切

10、割识别序列后产生的粘性末端：GOGGCGGC子-GC蟲3Q艶宙选择质粒pET-28a作为载体的原因：pET原核表达质粒是最有效的原 核表达系统之一。目的基因被克隆到 pET质粒载体上，受噬菌体T7 强转录及翻译信号控制；表达由宿主细胞提供的 T7RNA聚合酶诱导。宿主菌带有受lacUV5控制的T7RN骤合酶基因，可以通过IPTG来启 动表达。充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱 导表达后仅几小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。实验用品：1. 材料：实验一提取的质粒 pEGFP-N和pET-28a, 0.2mlEP管，取液器吸头，一次性手套；2. 试剂：Notl，B

11、amHI ddH2O,10xBuffer，引物，琼脂糖，Gold view ；3. 设备：移液器，台式高速离心机，凝胶电泳系统，凝胶成像系统， 恒温培养箱。实验步骤：1. 分别取两支0.2mlEP管做上标记；2. 两个EP管中分别配置以下的30uL体系：号EP管号EP管水9uL水9uL10xBuffer3uL10xBuffer3uLNotI1uLNotI1uLBamHI2uLBamHI2uLpET-28a15uLpEGFP-N315uL3. 将两只EP管混匀后瞬时离心，放入恒温培养箱 37C酶切1h；4. 取5uLEP管的酶切反响液，同时取5uL原质粒溶液作对照，进 行电泳检测酶切结果；5.

12、按照回收试剂盒步骤切胶回收所需酶切产物片段。实验五DNA的连接重组实验原理：连接的DNA分子具备的条件：具有相同粘性末端同种 酶切的片段的DNA分子比拟容易连接在一起，因为相同的粘性末端 容易通过碱基配对氢键形成一个相对稳定的结构； ：连接反响温度: 理论上讲，连接反响的最正确温度是 37C，此时脸姐妹的活性最高。但37C粘性末端分子形成的配对结构极不稳定，因此，人们找到了 一个最适温度，即12-16 C。此时既可以最大限度地发挥连接酶的活 性，又有助于短暂配对结构稳定。本实验选择16C。实验用品：1. 材料：酶切后的EGFP RFP和pET-28a、0.2mlEP管、取液器吸头、一次性手套；

13、2. 试剂：T4DNA连接酶、ddH2O T；DNA连接酶 buffer ;3. 设备：移液器、台式高速离心机、PCF仪。、实验步骤：1. 在EP管中分别配置以下的体系：0.2mlEP 管10xBuffer2.5uL酶切后的pET-28a7.5uL酶切后的荧光基因片段13uLT4DNA1接酶考虑连接效率2uLX: Y =1:10-30.总体积 25uL2. EP管中液体混匀后瞬时离心，放入培养箱 22C反响20min, -20 C 下保存用于转化。实验六 重组质粒转入DH5a扩增实验原理：重组DNA分子的转化原理：细菌处于容易吸收外缘 DNA勺生理状态叫 感受态。转化是指质粒DNA或以它为载体

14、构建重组 DNA分子导入细菌 的过程。其原理是细菌处于0C,在有CaCI2存在的低渗溶液中，菌 细胞膨胀成球形。转化混合物中的 DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸 复合物粘附于细胞外表，经42C短时间热击处理，促进细胞吸收DNA 复合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型如 Amp等 得到表达。在选择培养基上进行 重组子的鉴定。实验步骤：1. 取出感受态细胞DHa让其在冰上自然解冻，每200uL解冻的感受 态细胞参加整管连接产物，混匀后冰浴 30mi n;2. 42 C热冲击90S,立即置于冰浴5min;3. 再在感受态细胞混合物中参加 0.8mL的LB培

15、养基，于37C摇床中 培养1h;4. 1h后，6000rpm 3min，去掉上清液约留200uL的培养液，摇匀菌块；5. 用玻璃涂布器将溶液混匀涂布在含 Kana的LB固体培养基上，正置 培养皿半小时后，37 C培养箱中倒置培养皿过夜；6. 第二天早上观察结果实验七菌落PCF鉴定实验原理：PCF是在生物体外进行的由引物介导的酶促 DNA扩增反响，主要有变性-退火-延伸三个步骤组成：高温变性：94 C下DNA双链解旋为单链；低温退火：55 C左右时，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；中温延伸：72C时，Taq酶以4种dNTP为原料，弓I物为复制起点，按5'到3'方向，复制模

16、板的互补链；按此循环，一般重复25-30次，短时间内，使目的基因片段扩增 2n n代表循环次数。实验用品：1. 材料：DNA模板，4xdNTp T7正反引物，Taq酶，琼脂糖，MarkerDNA 吸头；2. 试剂：10xBuffer , 15mmol/L MgCI2, T7启动子正向引物：5' -TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-T7 启动子反向引物：5' -TGC TAG TTA TTG CTC AGC GG-3 ；3. 仪器：PCR热循环仪，琼脂糖凝胶电泳系统。实验步骤：1.在0.2mLEP管内配制25uL PCR反响体系一个：反响物体积uLddH2O18.510 X Buffer2.5MgCl21.54X dNTP1T7启动子正向引物0.5T7启动子反向引物0.5Taq酶0.5菌落挑一个2用灭菌枪头挑单菌落接触 EP管内，混匀瞬时离心;3放入PCF仪中，设置反响程序：94C预变性5min :94C变性 30S;55C退火30S;72C延伸60S;重复步骤-30次； 72 C 延伸 10min;4. 取9uL反响液加1uL 10x loading buffer做电泳检测，分析所有目的 片段的大小。pET-28a-EGFP的表达：1.取出感受态细胞 BL21让其在冰上自然解 冻，5uLpE