蛋白质的盐析

1、蛋白质的盐析集团企业公司编码:LL3698-KKI1269-TM2483-LUI12689-ITT289-蛋白质的盐析验证型、 实 验目的了解在工业化生产过程中使用NHJ :SO】的情况，及NHJ ' SO使用 时的考前须知。二、实验原理用高浓度中性盐使蛋白质从溶液中沉淀出来的方法称盐析。常用的中性盐有NHJ : Sh、NaCI等。高浓度中性盐能使蛋白质沉淀是因为它具有脱水性，能脱去蛋白质胶粒水膜，又有中和蛋白质胶粒外双电层电 荷的 作用。不同蛋白质盐析时所需盐浓度不同，故调节盐浓度，可适当 地将蛋 白质分开。如球蛋白在半饱和硫酸镀溶液中沉淀，清蛋白在饱和 硫酸镂溶 液中沉淀，用盐析法

2、沉淀的蛋白质并未变性，用稀释的方法或 透析的方法 可使之复溶。三、器 材与试剂1、发酵溶液2、10%的三氯醋酸溶液3、饱和NHJ 2S0溶液4、NH. $0；粉末四、实 验步骤 取发酵溶液5ml,加饱和NH., 2SO4溶液Iml2ml3ml4ml5ml,混 匀，静 止数分钟，即有白色沉淀析出，应为何物？过滤至清，除去沉 淀，滤液备 用。取少量沉淀，加 H】 0看是否复溶 ?2取滤液0.5ml，加10%的三氯醋酸数滴，有白色沉淀产生，应为何 物?然后在721分光光度计0D6C。下进行透光率的检测，检测时必须在倒 入比 色皿以后 10秒内读取为什么?。 在进行检测时应注意将 721 分光光度 计

3、调整到ODgoO ；在测量前应把机器预热半小时左右。在检测时 应注意有 效的检测范围是T值15%以上到70%以下。3另外，取滤液2. 5ml于小烧杯中，加NHJ芬0;粉末，随加随搅 拌， 直至NHJ不能溶解为止，有白色沉淀产生，应为何物？然后过 滤至清，除 去沉淀，过滤备用。4将1 - 3做的滤液中加 10%三氯醋酸数滴观察有无沉淀产 生。 找到没有沉淀的加饱和 NH; 野 0溶液的点。然后在 721 分光光度计 0D 缈下进行透光率的检测。并且作出曲线。5对大量的发酵液进行处理， 在滤液中加 10%三氯醋酸数滴观察有无 沉 淀产生。6盐析曲线的制作方法： 如果要别离一种新的蛋白质和酶， 没有

4、文献 数据可以借鉴， 那么应先确定沉淀该物质的硫酸镀饱和度。 具体操作方法 如下： 取已定量测定蛋白质或酶的活性与浓度的待别离样品溶液，冷至0°C? 5°C,调至该蛋白质稳定的pH值，分6? 10次分别参加不同量的硫 酸钱，第一次 加硫酸镀至蛋白质溶液刚开始出现沉淀时， 记下所加硫酸 钱的量， 这是盐析 曲线的起点。 继续加硫酸镀至溶液微微混浊时， 静止 一段时间， 离心得到第 一个沉淀级分， 然后取上清再加至混浊， 离心得 到第二个级分， 如此连续可 得到 6? 10个级分，按照每次参加硫酸钱的 量，查出相应的硫酸钱饱和度。将每一级分沉淀物分别溶解在一定体积 的适宜的 P

5、H 缓冲液中，测定其蛋白 质含量和酶活力。 以每个级分的蛋白 质含量和酶活力对硫酸钱饱和度作图， 即可得到盐析曲线。五、盐析考前须知：1. 盐析的成败决定于洛液的PH值与离子强度，溶液pH值越接近蛋白的等 电点，蛋白质越容易沉淀。2. 盐析一般用的硫酸钱，容易吸潮，因而在使用前，一般先磨碎，平铺 放 入烤箱内 60°C 烘干后再称量，这样更准确。3. 在参加盐时应该缓慢均匀，搅拌也要缓慢，越到后来速度应该更注意 缓 慢，如果出现一些未溶解的盐，应该等其完全溶解后再加盐，以免引 起局 部的盐浓度过高，导致酶失活。4. 盐析后最好搅拌 40 分钟到一个小时而且再在冰浴中放置一段时间。为

6、了防止盐对酶的影响，一般脱盐处理后再测酶活性。5. 盐析后的蛋白质最好尽快脱盐处理，以免变性，透析较慢，一般可用 超 滤或者 G-25, G-50 处理。6. 一般粗提物蛋白完全沉淀是在硫酸钱浓度在 70%左右。六、盐析影响因素：1. 蛋白质的浓度：中性盐沉淀蛋白质时，溶液中蛋白质的实际浓度对分 离 的效果有较大的影响。通常高浓度的蛋白质用稍低的硫酸镀饱和度即 可将 其沉淀下来，但假设蛋白质浓度过高，那么易产生各种蛋白质的共沉淀 作用， 除杂蛋白的效果会明显下降。对低浓度的蛋白质，要使用更大的 硫酸镀饱 和度，但共沉淀作用小，别离纯化效果较好，但回收率会降 低。通常认为比拟适中的蛋白质浓度是

7、2.5%? 3.0%,相当于 25mg/mL? 30mg/mL2. 离子强度：各种蛋白质的沉淀要求不同的离子强度。3. 盐的性质：最有效的盐是多电荷阴离子。4. pH 值：一般说来，蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度就越大。改变PH 值可改变蛋白质的带电性质，因而就改变了蛋白质的溶解度。远离等电点处溶解度大，在等电点处溶解度小，因此用中性盐沉淀蛋白质时，PH 值常选在该蛋白质的等电点附近。5. 温度：除对温度敏感的蛋白质在低温4°C操作外，一般可在室温 中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质如血红蛋白、 肌红 蛋白、清蛋白在较高的温度 25°C比0°C时溶解度低，更容易盐 析。 蛋白质沉淀后宜在4°C放3小时以上或过夜，以形成较大沉淀而易于分离。盐析时，分子量较