肉毒梭菌及其毒素检验

1、动物检疫检验技术专业教学资源库肉毒梭菌及其毒素检验肉毒梭菌及其毒素检验 知识目标：知识目标： 理解肉毒梭菌的生物学特性。理解肉毒梭菌的生物学特性。 了解肉毒梭菌及其毒素的致病性。了解肉毒梭菌及其毒素的致病性。 掌握肉毒梭菌及其毒素标准检验方法。掌握肉毒梭菌及其毒素标准检验方法。 能力目标：能力目标： 会制备肉毒梭菌及其毒素检验用培养基。会制备肉毒梭菌及其毒素检验用培养基。 会对肉毒梭菌及其毒素进行检验。会对肉毒梭菌及其毒素进行检验。 动物检疫检验技术专业教学资源库肉毒梭菌及其毒素检验肉毒梭菌及其毒素检验肉毒梭菌肉毒梭菌n 肉毒梭菌是一种腐物寄生菌，在自然界分布肉毒梭菌是一种腐物寄生菌，在自然界

2、分布很广，土壤、霉干草和畜禽粪便中均有存在很广，土壤、霉干草和畜禽粪便中均有存在，可分为，可分为A A至至G G七个型。七个型。n 肉毒中毒是一种较严重的食物中毒，它是肉肉毒中毒是一种较严重的食物中毒，它是肉毒梭菌的外毒素所引起的。早在毒梭菌的外毒素所引起的。早在1818世纪末以前，世纪末以前，在德国引起中毒的食品主要是腊肠，所以称为在德国引起中毒的食品主要是腊肠，所以称为腊肠中毒腊肠中毒（BotuLismBotuLism）。在我国过去译为腊肠）。在我国过去译为腊肠中毒，把肉毒梭菌译为腊肠杆菌或腊肠梭菌，中毒，把肉毒梭菌译为腊肠杆菌或腊肠梭菌，现在改称为肉毒梭菌。现在改称为肉毒梭菌。动物检疫检

3、验技术专业教学资源库肉毒梭菌及其毒素检验肉毒梭菌及其毒素检验n 引起肉毒中毒主要是食入含有肉毒毒素的食品，食品在调制加工、运输引起肉毒中毒主要是食入含有肉毒毒素的食品，食品在调制加工、运输贮存的过程中，污染了肉毒梭菌芽胞，在适宜条件下，发芽、增殖并产贮存的过程中，污染了肉毒梭菌芽胞，在适宜条件下，发芽、增殖并产生毒素所造成的。生毒素所造成的。n 国外引起肉毒中毒的食品多为肉类及各种鱼、肉制品、火腿、腊肠以及国外引起肉毒中毒的食品多为肉类及各种鱼、肉制品、火腿、腊肠以及豆类、蔬菜和水果罐头。豆类、蔬菜和水果罐头。n 中毒食品种类往往与饮食习惯有关。如欧洲各国主要的中毒食品为火腿中毒食品种类往往与

4、饮食习惯有关。如欧洲各国主要的中毒食品为火腿、腊肠和其他兽肉、禽肉等。美国主要是家庭制的水果罐头，而火腿、腊肠和其他兽肉、禽肉等。美国主要是家庭制的水果罐头，而火腿、腊肠等畜禽肉加工食品仅占腊肠等畜禽肉加工食品仅占7.7%7.7%，日本和俄罗斯等国家鱼制品中毒者最，日本和俄罗斯等国家鱼制品中毒者最多，尤其是日本，几乎全部是鱼制品的多，尤其是日本，几乎全部是鱼制品的E E型中毒。型中毒。动物检疫检验技术专业教学资源库肉毒梭菌及其毒素检验肉毒梭菌及其毒素检验n 国内因肉类食品及罐头食品引起的中毒的较少，据有关资料调查统计，国内因肉类食品及罐头食品引起的中毒的较少，据有关资料调查统计，主要是臭豆腐、

5、豆鼓、面酱、红豆制品、烂土豆等植物性食品引起的中主要是臭豆腐、豆鼓、面酱、红豆制品、烂土豆等植物性食品引起的中毒多见。毒多见。n 肉毒梭菌的抵抗力一般，但其芽胞的抵抗力很大，可耐煮沸肉毒梭菌的抵抗力一般，但其芽胞的抵抗力很大，可耐煮沸1 16 6小时之小时之久，于久，于180180干热干热5 51515分钟才能破坏，分钟才能破坏，120120高压蒸气下高压蒸气下10102020分钟才分钟才能杀死。能杀死。10%10%盐酸须经盐酸须经1 1小时才能破坏。在酒精中能存活小时才能破坏。在酒精中能存活2 2个月。其中以个月。其中以A A、B B型菌的芽胞抵抗力最强。这一点对于罐头食品的灭菌很重要，若芽

6、型菌的芽胞抵抗力最强。这一点对于罐头食品的灭菌很重要，若芽胞深藏于食品中，或者数量过多，虽经高温灭菌，有时也不易杀死芽胞胞深藏于食品中，或者数量过多，虽经高温灭菌，有时也不易杀死芽胞，故应特别注意。肉毒毒素抵抗力也较强，故应特别注意。肉毒毒素抵抗力也较强，80308030分钟或分钟或1001010010分钟分钟才能完全破坏。正常胃液和消化酶于才能完全破坏。正常胃液和消化酶于2424小时不能将其破坏，可被胃肠道小时不能将其破坏，可被胃肠道吸收而中毒。吸收而中毒。动物检疫检验技术专业教学资源库肉毒梭菌及其毒素检验肉毒梭菌及其毒素检验n形态及染色：形态及染色：本菌为革兰氏染色阳本菌为革兰氏染色阳性的

7、大杆菌，长性的大杆菌，长4 46um,6um,宽宽0.90.91.2um1.2um，多单在，偶见成双或短链。，多单在，偶见成双或短链。菌端钝圆。有周身鞭毛，无荚膜，菌端钝圆。有周身鞭毛，无荚膜，芽胞为椭圆形，芽胞为椭圆形，A A、B B型菌的芽胞大型菌的芽胞大于菌体，位于菌体近端，使菌体呈于菌体，位于菌体近端，使菌体呈匙形或网球拍状，另外四型菌的芽匙形或网球拍状，另外四型菌的芽胞一般不超过菌体宽度。胞一般不超过菌体宽度。一、生物学性状一、生物学性状动物检疫检验技术专业教学资源库肉毒梭菌及其毒素检验肉毒梭菌及其毒素检验n培养特性：培养特性：本菌为最严格的厌氧菌，本菌为最严格的厌氧菌，对营养要求不

8、高，在普通培养基上都对营养要求不高，在普通培养基上都能生长。发育最适宜温度为能生长。发育最适宜温度为28283737，pHpH为为6.86.87.67.6，产毒的最适，产毒的最适pHpH为为7.87.88.28.2。血清琼脂：培养血清琼脂：培养48487272小时，形成小时，形成中央隆起，边缘不整齐、灰白色、表中央隆起，边缘不整齐、灰白色、表面较粗糙的绒球状菌落。直径可达面较粗糙的绒球状菌落。直径可达6 610mm10mm。血液琼脂：菌落周围有溶血区。血液琼脂：菌落周围有溶血区。血液琼脂血液琼脂动物检疫检验技术专业教学资源库肉毒梭菌及其毒素检验肉毒梭菌及其毒素检验n培养特性：培养特性：普通琼脂

9、：形成灰白色、半透明、边缘不整齐。呈绒毛网普通琼脂：形成灰白色、半透明、边缘不整齐。呈绒毛网状、向外扩散的菌落。直径约为状、向外扩散的菌落。直径约为3 35mm5mm。肉渣肉汤：呈均匀混浊生长，肉渣可被肉渣肉汤：呈均匀混浊生长，肉渣可被A A、B B和和F F型菌消化溶型菌消化溶解成烂泥状，并发黑，产生腐败恶臭味，从第三天起，菌体解成烂泥状，并发黑，产生腐败恶臭味，从第三天起，菌体下沉，肉汤变清。在肉渣培养基和半固体培养基，大量产气。下沉，肉汤变清。在肉渣培养基和半固体培养基，大量产气。动物检疫检验技术专业教学资源库肉毒梭菌及其毒素检验肉毒梭菌及其毒素检验n 生化特征生化特征本菌生化特性很不规

10、律，一般能分解葡萄糖、麦芽糖、本菌生化特性很不规律，一般能分解葡萄糖、麦芽糖、果糖产酸产气。对明胶、凝固血清、凝固蛋白均有分解果糖产酸产气。对明胶、凝固血清、凝固蛋白均有分解作用，并引起液化。不形成靛基质，能产生硫化氢。作用，并引起液化。不形成靛基质，能产生硫化氢。 动物检疫检验技术专业教学资源库肉毒梭菌及其毒素检验肉毒梭菌及其毒素检验n菌型及毒素菌型及毒素目前已知肉毒梭菌有目前已知肉毒梭菌有A A、B B、C C、D D、E E、F F、G G等等7 7个菌型，其中个菌型，其中C C型还有型还有CC和和CC两个两个亚型。引起人群中毒的主要是亚型。引起人群中毒的主要是A A、B B、E E三型

11、，三型，C C、D D型主要是畜禽肉毒中毒的病原，型主要是畜禽肉毒中毒的病原，F F型只见报导发生在个别地区的人，如丹麦和美国各一起。型只见报导发生在个别地区的人，如丹麦和美国各一起。19801980年从瑞士五名突然死年从瑞士五名突然死亡病例中发现亡病例中发现G G型毒素。型毒素。各型肉毒梭菌产生相应型的毒素，所以肉毒毒素也分为各型肉毒梭菌产生相应型的毒素，所以肉毒毒素也分为A A、B B、C C、D D、E E、F F、G G等等7 7型，型，C C型包括型包括CC和和CC两个亚型。两个亚型。肉毒毒素是在肉毒梭菌胞浆中产生，由菌体释放到培养基中，经滤过除菌所得滤肉毒毒素是在肉毒梭菌胞浆中产生

12、，由菌体释放到培养基中，经滤过除菌所得滤液即为毒素液。毒素形成的最适宜温度为液即为毒素液。毒素形成的最适宜温度为28283737，温度低于，温度低于88与与pHpH在在4.04.0以下时，以下时，则不能形成。则不能形成。肉毒梭菌产生的毒素是一种神经毒素，是目前已知的化学毒物与生物毒素中毒性肉毒梭菌产生的毒素是一种神经毒素，是目前已知的化学毒物与生物毒素中毒性最强的一种，对人的致死量为最强的一种，对人的致死量为1010-9-9mg/Kgmg/Kg体重。其毒力比氰化钾还要大一万倍。体重。其毒力比氰化钾还要大一万倍。动物检疫检验技术专业教学资源库肉毒梭菌及其毒素检验肉毒梭菌及其毒素检验二、致病性二、

13、致病性n 肉毒毒素是一种与神经亲和力较强的毒素，肉毒毒素经肠道吸收后，肉毒毒素是一种与神经亲和力较强的毒素，肉毒毒素经肠道吸收后，作用于外周神经肌肉接头，植物神经末梢以及颅脑神经核，毒素能阻作用于外周神经肌肉接头，植物神经末梢以及颅脑神经核，毒素能阻止乙酰胆碱的释放，导致肌肉麻痹和神经功能不全。在临床上表现以止乙酰胆碱的释放，导致肌肉麻痹和神经功能不全。在临床上表现以中枢神经系统中毒症状为主，肉毒毒素中毒潜伏期长短不一，短者中枢神经系统中毒症状为主，肉毒毒素中毒潜伏期长短不一，短者2 2小小时，长者可达数天，一般为时，长者可达数天，一般为12122424小时。中毒症状，早期为瞳孔放大小时。中毒

14、症状，早期为瞳孔放大、明显无力、虚弱、晕眩，继而出现视觉不清和雾视，愈来愈感到说、明显无力、虚弱、晕眩，继而出现视觉不清和雾视，愈来愈感到说话和吞噬困难，通常还可见到呼吸困难，体温一般正常，胃肠道症状话和吞噬困难，通常还可见到呼吸困难，体温一般正常，胃肠道症状不明显。病程一般为不明显。病程一般为2 23 3天，也有的长达天，也有的长达2 2周之久。肉毒中毒死亡率较周之久。肉毒中毒死亡率较高，据报导可达高，据报导可达30%30%50%50%，死亡主要是由于呼吸麻痹及心肌痪瘫。如，死亡主要是由于呼吸麻痹及心肌痪瘫。如早期使用型特异或多价抗血清治疗，死亡率可降至早期使用型特异或多价抗血清治疗，死亡率

15、可降至10%10%15%15%。动物检疫检验技术专业教学资源库肉毒梭菌及其毒素检验肉毒梭菌及其毒素检验三、检验方法三、检验方法n中华人民共和国国家标准中华人民共和国国家标准食品卫生检验方法（食品卫生检验方法（微生物学部分）微生物学部分）肉毒梭菌及其毒素的检验方法肉毒梭菌及其毒素的检验方法 GB4789.12-2003GB4789.12-2003 。n中华人民共和国出入境检验检疫行业标准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准食品食品中肉毒梭菌的中肉毒梭菌的PCR检测方法检测方法SN/T2525-2010SN/T2525-2010 。 动物检疫检验技术专业教学资源库肉毒梭菌及其毒素检验肉毒梭菌及其毒

16、素检验检验方法（检验方法（GB4789.12GB4789.12）肉毒梭菌检出分离培养结果报告肉毒毒素检验动物检疫检验技术专业教学资源库肉毒梭菌及其毒素检验肉毒梭菌及其毒素检验（一）肉毒毒素检验（一）肉毒毒素检验样品的处理123毒力测定4定型试验5 检出试验 确证试验动物检疫检验技术专业教学资源库肉毒梭菌及其毒素检验肉毒梭菌及其毒素检验n 液体检样可直接离心，固体或半流动检样须加适量（例液体检样可直接离心，固体或半流动检样须加适量（例如等量、倍量或如等量、倍量或5 5倍量、倍量、1010倍量）明胶磷酸盐缓冲液，浸倍量）明胶磷酸盐缓冲液，浸泡、研碎，然后，取上清液进行检测。泡、研碎，然后，取上清液

17、进行检测。n 另取一部分上清液，调另取一部分上清液，调pH6.2pH6.2，每份加，每份加10%10%胰酶（活力胰酶（活力1 1：250250）水溶液）水溶液1 1份，混匀，不继轻轻搅动，份，混匀，不继轻轻搅动，3737作用作用60min60min，进行检测。，进行检测。1.1.样品的处理样品的处理动物检疫检验技术专业教学资源库肉毒梭菌及其毒素检验肉毒梭菌及其毒素检验n 试验方法：试验方法：取样品处理完的上清液及其胰酶激活处理液分别注射小白取样品处理完的上清液及其胰酶激活处理液分别注射小白鼠三只，每只鼠三只，每只0.5mL0.5mL，观察，观察4d4d。n 结果观察：结果观察：注射液中若有肉毒

18、毒素存在，小白鼠一般多在注射后注射液中若有肉毒毒素存在，小白鼠一般多在注射后24h24h内发病死亡。内发病死亡。如遇小鼠猝死以至症状不明显时，则可将注射液做适当稀释，重做试如遇小鼠猝死以至症状不明显时，则可将注射液做适当稀释，重做试验。验。主要症状为竖毛、四肢瘫软，呼吸困难，呼吸呈风箱式，腰部凹陷，主要症状为竖毛、四肢瘫软，呼吸困难，呼吸呈风箱式，腰部凹陷，宛若蜂腰，最终死于呼吸麻痹。宛若蜂腰，最终死于呼吸麻痹。2.2.检出试验检出试验动物检疫检验技术专业教学资源库肉毒梭菌及其毒素检验肉毒梭菌及其毒素检验n 结果判定：结果判定：若注射加诊断血清与煮沸加热的两份混合液的小白鼠均获若注射加诊断血清

19、与煮沸加热的两份混合液的小白鼠均获得保护存活。得保护存活。注射未经其他处理的混合液的小白鼠以特有的症状死亡。注射未经其他处理的混合液的小白鼠以特有的症状死亡。可判定检样中的肉毒毒素存在，必要时进行毒力测定及定可判定检样中的肉毒毒素存在，必要时进行毒力测定及定型试验。型试验。3.3.确证试验确证试验动物检疫检验技术专业教学资源库肉毒梭菌及其毒素检验肉毒梭菌及其毒素检验n 不论上清液或其胰酶激活处理液，凡能致小白鼠发病、死亡不论上清液或其胰酶激活处理液，凡能致小白鼠发病、死亡者，取样分成者，取样分成三份三份进行试验：进行试验：一份加等量多型混合肉毒抗毒诊断血清，混匀，一份加等量多型混合肉毒抗毒诊断

20、血清，混匀，3737作用作用30min30min。一份加等量明胶磷酸盐缓冲液，混匀，煮沸一份加等量明胶磷酸盐缓冲液，混匀，煮沸10min10min。一份加等量明胶磷酸盐缓冲液，混匀即可，不做其他处理。一份加等量明胶磷酸盐缓冲液，混匀即可，不做其他处理。n 三份混合液分别注射小白鼠各两只，每只三份混合液分别注射小白鼠各两只，每只0.5mL,0.5mL,观察观察4d4d。3.3.确证试验确证试验动物检疫检验技术专业教学资源库肉毒梭菌及其毒素检验肉毒梭菌及其毒素检验n 取已判含有肉毒毒素的检样离心上清液，用明胶磷酸盐缓取已判含有肉毒毒素的检样离心上清液，用明胶磷酸盐缓冲液做成冲液做成5050倍、倍、

21、500500倍及倍及50005000倍的稀释液，分别注射小白倍的稀释液，分别注射小白鼠各两只，每只鼠各两只，每只0.5mL,0.5mL,观察观察4d4d。根据动物死亡情况，计算。根据动物死亡情况，计算检样所含肉毒毒素的大体毒力（检样所含肉毒毒素的大体毒力（MLD/MLD/mLmL或或MLD/gMLD/g）。）。4.4.毒力测定毒力测定动物检疫检验技术专业教学资源库肉毒梭菌及其毒素检验肉毒梭菌及其毒素检验n 按毒力测定结果，用明胶磷酸盐缓冲液将检样上清液稀释按毒力测定结果，用明胶磷酸盐缓冲液将检样上清液稀释至所含毒素的毒力大体在至所含毒素的毒力大体在10MLD/mL10MLD/mL1000MLD

22、/mL1000MLD/mL的范围，的范围，分别与各单型肉毒抗诊断液血清等量混匀，分别与各单型肉毒抗诊断液血清等量混匀，3737作用作用30min30min，各注射小白鼠两只，每只，各注射小白鼠两只，每只0.5mL0.5mL，观察，观察4d4d。同时以。同时以明胶磷酸盐缓冲液代替诊断血清，与稀释毒素等量混合作明胶磷酸盐缓冲液代替诊断血清，与稀释毒素等量混合作为对照。能保护动物免于发病、死亡的诊断血清即为检样为对照。能保护动物免于发病、死亡的诊断血清即为检样所含肉毒毒素的型别。所含肉毒毒素的型别。5.5.定型试验定型试验动物检疫检验技术专业教学资源库肉毒梭菌及其毒素检验肉毒梭菌及其毒素检验（二）肉

23、毒梭菌检出（增菌产毒培养）试验（二）肉毒梭菌检出（增菌产毒培养）试验n 取庖肉培养基三支，煮沸取庖肉培养基三支，煮沸10min10min15min15min，做如下处理：，做如下处理：第一支：急速冷却，接种检样均质液第一支：急速冷却，接种检样均质液1mL1mL2mL2mL；第二支：冷却至第二支：冷却至6060，接种检样，继续于，接种检样，继续于6060保温保温10min10min，急速冷却；，急速冷却；第三支：接种检样，继续煮沸加热第三支：接种检样，继续煮沸加热10min10min，急速冷却。，急速冷却。n 培养：培养：3030，5d5d。n 观察结果：观察结果：若无生长，可再培养若无生长，可再培养10d10d。培养到期，若有生长，取培养液离心，以其上清液进行毒素检测试验培养到期，若有生长，取培养液离心，以其上清液进行毒素检测试验，方法同肉毒毒素的检验，阳性结果证明检样中有肉毒梭菌存在。，方法同肉毒毒素的检验，阳性结果证明检样中有肉毒梭菌存在。动物检疫检验技