重组人甲状旁腺激素肽（1-34）在大肠杆菌中的高效融合表达及纯化

1、重组人甲状旁腺激素肽（1-34）在大肠杆菌中的高效融合表达及纯化中国生物工程杂志ChinaBiotechnology,2006,26(3):2630重组人甲状旁腺激素肽(134)在大肠杆菌中的高效融合表达及纯化木李健峰肖红剑姬秋彦李智华龙海亭阎玲梅罗娜徐维明(中国医学科学院中国协和医科大学医学生物学研究所昆明650118)摘要人工合成人甲状旁腺激素134肽段(PTH1-34)的cDNA序列,克隆到大肠杆菌蛋白表达载体pThioHis中,获得了高表达菌株.经发酵,破茵,金属螯合层析,反相层析和凝胶层析后获得了纯度大于95%的hPTH1-34,hPTH1.34肽N端测序和质谱分子量测定结果与天然P

2、TH1.34一致.生物学活性研究表明,hPTH1-34在体外具有刺激腺苷酸环化酶的作用.关键词人甲状旁腺激素大肠杆菌融合表达人甲状旁腺激素(parathyroidhormone,PI1H)是生物体内由甲状旁腺主细胞分泌的一种多肽激素,在调节体液钙磷浓度维持相对稳定的过程中发挥着重要作用.PI1H分子是由84个氨基酸组成的一条直肽链,研究发现,完整的多肽对其生物学活性是非必须的,发挥钙磷调节作用仅需N端134氨基酸残基组成的肽段【2l.PI1H1-34通过与受体结合后激活腺苷酸环化酶系统和蛋白激酶c的活性,改变骨吸收和骨合成的速率,影响骨代谢llJ.目前临床研究显示,PTH104在低浓度的间歇注

3、射可以促进骨合成速率,提高骨质密度和骨质量,有效治疗低血钙导致的骨质疏松症-3J.传统的由动物组织中提取PTH的方法,效率和产量极低,限制了PTH的研究和应用,因此,利用基因工程技术高效地生产具有生物学活性的重组PTH134具有实际应用价值.利用基因工程技术,在大肠杆菌中高效融合表达了hPTH1-34,并对hPTH134发酵工艺和纯化工艺进行了研究.l材料与方法1.1材料pThioHisA质粒,E.coliDH5ct,E.coliBL21为本研究室保存;大鼠骨肉瘤细胞株ROS17/2.8来源于中收稿日期:2005-06-29修回日期:20051031云南省自然科学基金资助项目(2005C006

4、2M)通讯作者,电子信箱:xuwmyn国农业大学生物学院;羊抗人PI1H1.34抗体购自SantaCruz公司;cAMP放射免疫分析试剂盒购自中国原子能科学研究院;各种工具酶购自TaKaRa公司及华美生物工程公司;牛肠激酶为本实验室酵母表达生产所得.1.2人PTH1-34DNA片段的合成,克隆及融合表达载体的构建在不改变氨基酸序列的前提下,选择来自WWW.kazusa.or.jp/code网站的大肠杆菌偏爱密码子,并考虑二级结构因素,设计了编码人PTH1-34的DNA序列.并在上游酶切位点BamHI和PTH1.34基因起始密码子之间引入编码肠激酶切割识别位点AspAspAspAspLys的碱基

5、序列GACGACGACGACAAG.设计后的基因由TaKaRa公司合成后,与BamHI和EcoRI双酶切的载体pUC18连接.转化EcoliDI-15a,筛选重组子和测序后,获得了一个序列完全正确的质粒,命名为pUC18.PTH(134).质粒pUC18一erH(134)用BamHI和EcoRI双酶切切下1bp小片段,与用BamIII和EcoRI双酶切的pThioHis.A载体连接,获得了表达硫氧还蛋白(Thioredoxin)和PTH134融合蛋白的质粒pThioHis,PTH1-34.1.3工程菌的构建及融合蛋白的表达将表达质粒pThioHisPTH1_34转化到E.coliBL21中构建

6、了工程菌E.coliBL21一PTH1.34.该工程菌接入含有50g/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中.37,180r/m,培养至OD6oo达O.40.6h,以终浓度为0.4mmol/L的IPTG诱导表达4h.取培养物1mI,离2006,26(3)李健峰等:重组人甲状旁腺激素肽(134)在大肠杆菌中的高效融合表达及纯化27心后采用SDSPAGE鉴定表达量.Westernblot鉴定所表达的融合蛋白,抗为羊抗人PTH134,二抗为碱性磷酸酶标记的马抗羊IgG.1.4发酵培养1.4.1培养基组成LB种子培养基:每L含蛋白胨10g,酵母粉5g,NaC15g,pH7.0;高压灭菌,使用时加入氨苄青霉素

7、至100p.g,/ml.发酵培养基:每L含蛋白胨6.67g,酵母粉3.33g,葡萄糖1.67g,KH2PO4?3H2O3.33g,NaC13.33g,MgSO4?7H201.67g,柠檬酸三钠1.33g;高压灭菌后使用.补料培养基:每L含蛋白胨20g,酵母粉10g,微量元素15ml,IPTG0.33g,维生素B10.033g,MgSO47.3g,柠檬酸3g,甘油100ml,甲硫氨酸0.33g,分别高压和过滤后,混合备用.1.4.2发酵过程控制生长培养:将保存的菌种划平皿,挑取单个菌落,接种于LB种子培养基中,培养1416h后,再以1:30的比例扩大培养12h.然后接种于德国BraunC20发酵

8、罐中培养,培养温度30C,pH控制在6.87.2,罐压为常压,通过控制通气量和纯氧量使溶氧在30%以上.诱导培养:待OD6oo达到5.0时,加IFq'G至终浓度为0.4mmol/L.升温到36,诱导6h.诱导过程中根据养分消耗情况进行补料,约每间隔1h补料1次,并根据菌体生长情况调整pH和氧溶解度.1.5蛋白纯化1.5.1融合蛋白的提取收集发酵菌体后,按6ml/g菌体(v/w)将菌体溶于A液(20mmol/LPB,0.2moLNaCI,pH8.0)中,冰浴超声破菌;功率150W,时间30min;超声液4,10000r/min离心30min.收集上清液.1.5.2融合蛋白的纯化所有纯化均

9、在AKTAexplorer纯化仪上进行.ChelatingFF层析介质预处理后装柱,分别用50mmol/LEDTA,0.2mol/LNaOH,超纯水洗柱,然后用5倍体积50mmol/L的NiSO4缓慢过柱;用5倍以上柱体积(CV)的A液平衡后,将含融合蛋白的上清液上柱;先用A液平衡后,用B液(20mmol/LPB,0.2mol/LNaCI,50mmol/L咪唑,pH8.0)梯度洗脱,梯度为A.100%B,洗脱10个柱体积;收集蛋白峰,SDS-PAGE鉴定.1.5.3hPTH(134)的纯化取亲和层析后的纯化产物,按融合蛋白;肠激酶体积比1000:1加入肠激酶(EKase),4C酶切12h;用高

10、压玻璃柱装Sourse15RPC100ml(Pharmacia公司)制备反相层析柱,按凝胶说明书处理后.取酶切后的蛋白溶液上柱,用A液(0.3%三氟乙酸,)冲洗后,用B液(70%乙晴+0.3%三氟乙酸)梯度洗脱,梯度为A一100%B,洗脱体积为5个柱体积;检测波长为215nm,收集蛋白峰,电泳鉴定hFq'H纯度.凝胶过滤玻璃柱采用7.5cm×140em装6000mlSuperdex一30(Pharmacia公司),取反相柱纯化的样品峰组分进一步过滤纯化,洗脱液为20mmol/L磷酸缓冲液(PBpH7.5);检测波长为215nm,收集蛋白峰,电泳鉴定hFq'H纯度.1.

11、6理化和生物学活性测定用C18柱(Waters公司)的HPLC进行纯度检测.流动相为A:5%乙腈+0.1%三氟乙酸;B:95%乙腈+0.1%三氟乙酸.上样量不低于20p.g,于215nm处检测,按面积均一化计算峰面积.N末端15个氨基酸的测序由中国科学院昆明动物所完成,分子量由上海基康生物技术有限公司用飞行时间质谱(MALDITOFMS)测定.ROS17/2.8细胞在含10%小牛血清的F12培养基中培养;细胞生长至对数生长期时,胰酶消化细胞,稀释到1×10./ml,加2501xl稀释的细胞到小管中;将待测样品用含0.2mmol/LIBMX的培养液10倍系列稀释.力日2501稀释样品到

12、细胞管中,37作用10min;离心收集细胞后,TE洗涤细胞;正丁醇抽提细胞内cAMP,氮气回流干燥;用放免试剂盒测定cAMP浓度,结果表示为pmo1.P.g蛋白;每个样品稀释度平行做3次,同时以Sigma公司hPTH134为阳性对照.2结果2.1融合表达载体的构建为了实现hF'TH1-34在大肠杆菌中的高效表达,采用大肠杆菌偏爱密码子并调整了基因的二级结构,设计了如图1所示的基因序列为了使纯化的融合蛋白经切割后能产生与天然Fq'H相同的N端,在该序列的5端引入了肠激酶切割识别位点的核甘酸序列.构建后的表达质粒pThioHisPTH1-34,经BamHI和EcoRI双酶切后,得到

13、与预期相符的120bp片断(图2a).2.2融台蛋白的表达,鉴定及工程菌的发酵培养经SDSPAGE鉴定,硫氧还蛋白和PTH134融合的蛋白(ThioredoxinPTH134)在大肠杆菌中得到了表达,见图2b.经扫描确认表达量为27%.使用羊抗人28中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVo1.26No,32006EKase协割位瓤EKns识删位点JrBamHlAspAst)Aspasp1.ys.%rValSertGGATCC(;ATGAC(,ATGACAA(A(:(TI'CTCCTAGGCTACTCeTACTCTT(:TIGCACAGAGlulleGlnLuMetHis

14、AsnLeu(;lyLys3IGAAA1'r(:A(F(;ATGCATAAT(:H(;GTAAACTIIAM;TC(AcrAC(;TATrAGAC(:CAnTHisIuAHrrMCh王AVnH:ItLT【】6ICAT(TGAAC:TAlrI(;AACGTGTI;(认AT(;GGTAI;ACTI'CA(认TAC("兀CA(:AC(:TFA(:(:LeuArgLysLys1.euGlnAspValHisAsn9l1Tr;CGTAAAAAACT(AGGAT(71,GCATAA_rAA(;(:ATIIrrrIA(:GT(TACA(:GTAITAP如?I)【2I11TTAGGA

15、AT/AAAATC(:1TFAA(:图1优化设计的hPTH1-34序列Fig.1ThesyntheticsequenceofhPTH1-34eDNAFrill一34抗体进行Westernblot鉴定,表明表达获得了hPTH融合蛋白(图2c).p2000100075050025000图2rhPTH1-34融合蛋白的表达(a)重组表达载体限制性内切酶分析;1:Dl2000Marker2:pThioHis-PTH1-34质粒BamHI和EcoRl双酶切;(b)融合蛋白在大肠杆菌中的表达;1:Marker;2:pThioHis质粒,未诱导;3:pThioHis质粒,诱导;4:pThioHis-PTH1

16、-34质粒,未诱导;5:pThioHis-PTH134质粒,诱导;(c)表达的融合蛋白Westernblot结果;1:表达的Thioredoxin-PTH1-34融合蛋白;2:表达的硫氧还蛋白Fig.2rhPTHlexpressionoffusionprotein(a)RestrictionanalysisofrecombinantexpressionvectorpThioHisPTH1-34;(b)SDSPAGEanalysisofrhPTHI-34fusionexpressioninEcoli;(c)Westernblotresultoffusionproteinbyexpression采

17、用优化的条件发酵后,经SDSPAGE鉴定,在诱导5h和6h时,融合蛋白在大肠杆菌中表达量达到了38%(图3).2.3蛋白纯化菌体超声破菌后,融合蛋白主要在上清液中.将97.466.045.03l(J2I.54.5图3不同诱导时间融合蛋白的发酵结果1:诱导lh;2:诱导2h;3:诱导3h;4:诱导4h;5:诱导5h;6:诱导6h;Fig.3FermentationofrecombinantE.coilexpressingThioredoxin-PTH1-34fusionprotein上清液经Ni金属亲合层析纯化后,融合蛋白的纯度达到了85%以上(图4a).纯化的融合蛋白经酶切后,经反相柱层析(图

18、4b)和凝胶层析(图4c)分别纯化后,经小肽电泳鉴定,得到了单一的蛋白条带.kMI2kMI2k97.466.O45.03I.021.5I4.5(b)26.617.014.26.503.()图4rhffrH1-34融合蛋白的纯化(a)Ni"金属亲合层析纯化后融合蛋白的SDS-PAGE1:菌体裂解液上清;2:Ni金属亲合层析纯化的融合蛋白;(b)反相层析纯化hPTttl-34后的小肽电泳图;M:Marker;1:EKase酶切后融合蛋白;2:反相柱纯化的hPTHI-34;(c)凝胶过滤纯化hPTHI一34后的小肽电泳图;1:小肽分子量标准;2:凝胶过滤纯化的PTH134Fig.4Puri

19、factionofrlll阿HI(a)SDS-PAGEanalysisoffusionproteinpurifiedbyNi"Chelatingchromatography;(b)PeptideelectmphoresisanalysisofhPTH1-34purifiedbyreverseehmmatographY;(e)PeptideelectrophoresisanalysisofhPTH1-34purifiedbygelfilterchromatography2.4hPTH1-34理化性质鉴定纯化后的hVrH1-34用HPLC进行纯度检定,结果显示纯度达到97.8%(图5).

20、hFrH1-34氨基酸序列测一I2006,26(3)李健峰等:重组人甲状旁腺激素肽(134)在大肠杆菌中的高效融合表达及纯化29定结果表明,重组多肽N端15个氨基酸残基为:S-L-S-E-IQLMHNLGKHL,与预期结果一致,说明肠激酶在切割位点进行了精确切割.质谱测定结果显示,hPTH1,34的分子量为4131,与预期一致.图5hlrFH1-34HPLC纯度检测结果Fig.5HPLCpurifyassayresultofhPTHI-342.5hPTH1-34生物学活性测定根据PTH与骨肉瘤细胞上的受体结合后,能激活胞内腺苷酸环化酶,导致cAMP浓度升高的特性,进行hPTH1.34的活性测定

21、.测定结果显示hPTH1-34能刺激胞内cAMP的增加,活性与阳性对照相当(表1).表1hPTH1-34刺激腺苷酸环化酶实验TablelAdenylatecyclase8SSayofhPTH1-34实验组cAMP含量(pmol/1.trg蛋白)空白对照组阳性对照lO组样品1O组样品lO组样品lO组1.2l±O.12lO.33±0.44"19.46±0.62a)l0.67±0.276.02±0.31"Ja)P<0.05(相对于对照组),样品1O剂量组与阳性对照lO组问无统计学显着差异3讨论自从PTH1.34被发现

22、作为一种较强的骨形成刺激剂以来,国内外对其有效表达展开了广泛的研究.在全长PTH的表达研究中发现,由于PTH结构松散,易降解等原因,表达所得到的产物量极低且均一性差.目前已知,有多种因素影响外源基因在大肠杆菌中的表达,基因水平上有密码子的偏爱性,基因的二级结构,启动子的效率,启动子和ATG之间的距离等,其中,密码子的偏爱性和基因的二级结构等因素在实现外源基因高效表达的过程中尤为重要-6J.此外,PTH1-34的结构和功能的关系研究发现,在PTH的氨基端引入额外的氨基酸,会使其生物学活性显着降低【.而在大肠杆菌中表达外源基因时,在表达的产物N端经常形成甲硫氨酸或甲基甲硫氨酸,因此,在大肠杆菌中的

23、常规表达将影响PTH1-34的活性.综合PTH1-34分子量小,不易纯化等问题,将PTH1_34与其他大分子蛋白的融合表达将是解决这类问题的有效方法.从采用大肠杆菌偏好的密码子和二级结构优化角度设计了PTH104基因序列,将PTH1-34蛋白分子与具有亲和纯化特性的硫氧还蛋白进行融合表达,结果使ThioredoxinPTH1-34融合蛋白在E.coli中高效和呈可溶性表达.因此,融合蛋白表达技术能有效避免目的产物包涵体的形成,省略了包涵体提取和复性的复杂过程,对下游纯化步骤的简化提供了很好的基础.在基因工程产品的开发中,建立一个能获得高纯度,高活性和易规模化的纯化工艺对产品的最终质量控制尤为重

24、要.在以往的小分子多肽的纯化方法中,往往采用高压液相色谱柱进行纯化,用这种方法纯化的多肽纯度高,但不利于规模化生产.我们采用了易于规模化放大的反相柱纯化得到了较高纯度的hPTH134.此外,在最后纯化阶段使用的Superdex.30凝胶层析不仅可进一步对hPTHI-34进行纯化,而且能有效的实现热源控制.通过这些纯化步骤得到重组hPTHI-34纯度在95%以上,并且体外腺苷酸环化酶刺激结果表明获得的高纯度重组产物具有较好的活性,此纯化工艺的建立为大规模制备hPTH1-34打下了良好的基础.参考文献1HendyGN,KronenbergHM,PottsJT,ata1.Nucleotidesequ

25、enceofclonedcDNAsencodinghumanpreproparathyroidhormoneProcNatlAcadSciUSA,1981,78(12):73653842TregearGW,VanRietschotenJ,GreeneE,ata1.Bovinparathyroidhormone:minimumchainlengthofsyntheticpeptiderequireforbiologicalactivity.Endocrinology,1973,93:134913533WhitfieldJF,MorleyP.Smallbonebuildingfragmentsof

26、f,rH:newtherapeuticagentforosteoporosis.TrendsPharmacolSci,1995,16(1):3823864SchggerH,VonJagowG.Tricine-sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresisfortheseparationofproteinsintherangefrom1to100kDa.AnalBiochem,1987,166(2):36837930中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVo1.26No.320065SuzukiY,YabutaM.Ohsuy

27、eK.Hish-levelproductionofrecombinanthumanparathyroidhormonei-34.ApplEnvironMicrobiol,1998,64(2):5265296SungWL,ZahabDM,BarbierJR,eta1.SpecificdegeneratecodonsenhancedselectiveexpressionofhumanparathyroidhormoneinEscherichiacoli.JBiolChem,1991.266(5):283128357TakasuH,GardellaTJ,LuckMD,eta1.Amino-termi

28、nalmodificationsofhumanparathyroidhormoneselectivityalterphospholipaseCsignalingviathetypelPTHreceptor:implicationsfordesignofsignal-specificHligands.Biochemistry,1999,38(41):1345313460ExpressionandPurificationofHumanParathyroidHormonePeptide(1-34)inEscherichiacoliLIJian-fengXIAOHong-jianJIQiu?yanLIZhi-huaLONGHai?tingYANLing-meiLUONaXUWei-ruing(InstituteofMedicalBiology,ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollegeKunming650118,China)AbstractHu